TiO2納米管對牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、牙種植術(shù)是目前修復(fù)牙齒缺失或牙列缺損的重要方法之一，種植體與牙周組織直接接觸，缺少牙周膜樣的結(jié)構(gòu)作為緩沖，增加了種植體所受的力矩，使得種植體與骨之間結(jié)合欠佳或由于結(jié)合時間過久而導(dǎo)致種植手術(shù)的失敗。目前已有許多文獻(xiàn)報道了以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程再生技術(shù)能夠有效恢復(fù)受損的牙周組織。牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞作為牙周再生的種子細(xì)胞，具有多向分化和自我更新的潛能，是牙周組織再生的關(guān)鍵。
　　純鈦表面的納米管形貌能夠模擬自然的骨組織結(jié)構(gòu)

2、，因此從仿生學(xué)的角度來看納米管結(jié)構(gòu)具有較好的生物學(xué)活性。TiO2納米管形貌已經(jīng)普遍用于多種細(xì)胞的研究中，包括成骨細(xì)胞、纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、表皮角化細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。而納米管形貌對人來源的牙周膜干細(xì)胞和頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞的影響如何，目前還未見文獻(xiàn)報道，因此本課題研究了鈦表面納米管形貌對這兩種干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為優(yōu)化種植體的表面結(jié)構(gòu)、促進(jìn)種植體與牙周組織的結(jié)合，提供更加全面的理論指導(dǎo)。
　　實驗一 TiO2

3、納米管微觀形貌的制備
　　目的：在鈦表面構(gòu)建不同管徑的納米管形貌，為后續(xù)實驗提供研究模型。
　　方法：用不同粗度的砂紙將鈦表面拋光至鏡面，放置在含0.5％氫氟酸的電解液內(nèi)，在三種電壓下(5V、10V、20V)分別陽極氧化處理1 h，試樣表面超聲清洗后，采用場發(fā)射掃描電鏡觀察鈦表面的納米管形貌。
　　結(jié)果：鈦表面經(jīng)陽極氧化處理后形成排列整齊的均勻納米管結(jié)構(gòu)，納米管直徑大小與陽極氧化電壓成正相關(guān)，在5V、10V、20V電壓

4、下分別形成25、50和90 nm的納米管結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：陽極氧化能夠在鈦表面形成不同管徑的均勻TiO2納米管形貌。
　　實驗二 TiO2納米管對牙周膜干細(xì)胞成牙周組織的影響
　　目的：評價TiO2納米管形貌對牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)的形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成牙周組織能力的影響。
　　方法：采用有限稀釋法分離PDLSCs，將其接種于不同管徑的納米管表面，采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細(xì)胞的形態(tài)；用Hoe

5、chst染細(xì)胞核觀察細(xì)胞的粘附；CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖水平；ALP試劑盒檢測細(xì)胞的活性；天狼星紅染色觀察不同試樣表面膠原的分泌；茜素紅染色觀察不同試樣表面的胞外基質(zhì)礦化；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；實時定量PCR檢測細(xì)胞在納米管表面的基因水平。
　　結(jié)果：和Ti對照組相比，PDLSCs在不同管徑的納米管表面呈紡錘形生長，有許多的絲狀和板狀偽足，同時可以觀察到納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的早期粘附；細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，NT10

6、和NT20輕微促進(jìn)了PDLSCs的有絲分裂，而 CCK-8的結(jié)果顯示，納米管形貌抑制了PDLSCs的增殖，這可能由于在細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)生了拮抗反應(yīng)，也可能是由于不同實驗處理細(xì)胞的方法不同而產(chǎn)生的；納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的膠原分泌和Col-I、Col-III的基因表達(dá)；在未成骨誘導(dǎo)的條件下，納米管形貌不能促進(jìn) PDLSCs向成骨方向分化；在基因檢測中，NT5促進(jìn)了periostin和S100A4的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論：不同

7、管徑的納米管形貌能誘導(dǎo)細(xì)胞形成不同的細(xì)胞骨架形態(tài)，納米管形貌促進(jìn)了PDLSCs的早期粘附和膠原分泌，并促進(jìn)了相關(guān)基因的表達(dá)。
　　實驗三 TiO2納米管對頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：評價 TiO2納米管形貌對頜骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)形態(tài)變化、粘附行為、增殖能力及成骨分化能力的影響。
　　方法：將BMSCs純化后，接種于不同管徑的納米管表面，采用掃描電鏡觀察不同試樣表面細(xì)胞的形態(tài)；用 Hoechst

8、染細(xì)胞核觀察細(xì)胞的粘附；CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖水平；ALP試劑盒檢測細(xì)胞的活性；天狼星紅染色觀察不同試樣表面的膠原分泌；茜素紅染色觀察不同試樣表面胞外基質(zhì)礦化；實時定量PCR檢測細(xì)胞在納米管表面的基因水平。
　　結(jié)果：和Ti對照組相比，BMSCs在不同管徑的納米管表面伸展較快，有許多絲狀和板狀偽足伸出，同時可以觀察到納米管形貌促進(jìn)了BMSCs早期的粘附，其中NT5和NT10的細(xì)胞粘附數(shù)量有顯著性的差異；細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示

9、，NT5和NT10促進(jìn)了BMSCs在其表面的增殖水平，結(jié)果顯示BMSCs在小管徑表面增殖的能力較為明顯，隨著納米管直徑的增加，細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱；在成骨和未成骨誘導(dǎo)的條件下，NT20都促進(jìn)了BMSCs在納米管表面ALP的活性和膠原的分泌，且納米管形貌也促進(jìn)了Col-I和Col-III的基因表達(dá)；在未成骨誘導(dǎo)的條件下，納米管形貌沒有明顯促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化；在成骨相關(guān)的基因表達(dá)中，NT20促進(jìn)了ALP和R UN X2的表達(dá)上調(diào)

10、。
　　結(jié)論：納米管形貌促進(jìn)了BMSCs的早期粘附，小管徑的納米管形貌促進(jìn)了細(xì)胞增殖，大管徑的納米管形貌促進(jìn)了細(xì)胞的AL P活性、膠原分泌和成骨基因的表達(dá)。
　　實驗四復(fù)合細(xì)胞膜片在TiO2納米管周圍再生牙周組織的體內(nèi)研究
　　目的：構(gòu)建PDLSCs和BMSCs復(fù)合膜片，及其在TiO2納米管周圍再生牙周組織的體內(nèi)研究。
　　方法：采用有限稀釋法獲得人的PDLSCs和BMSCs；運用流式細(xì)胞術(shù)對兩種干細(xì)胞的表面分子

11、進(jìn)行檢測；克隆形成實驗觀察細(xì)胞的克隆能力；CCK-8試劑盒測定細(xì)胞的生長曲線；通過茜素紅和油紅染色觀察干細(xì)胞向成骨和成脂方向分化的潛能；維生素C誘導(dǎo)兩種干細(xì)胞形成細(xì)胞膜片；細(xì)胞膜片包裹Ti復(fù)合羥基磷灰石(HA)在體外培養(yǎng)1個月后檢測牙周相關(guān)的基因表達(dá)；兩種細(xì)胞膜片包裹不同管徑的TiO2納米管放置于HA孔內(nèi)，將其復(fù)合體植入裸鼠背部，8周后取材，進(jìn)行硬組織切片和VG染色，評價復(fù)合體在裸鼠體內(nèi)異位牙周再生的能力。
　　結(jié)果：通過有限稀釋

12、法分離獲得了人的PDLSCs和BMSCs，兩種細(xì)胞具有良好的克隆形成能力和增殖能力，通過流式細(xì)胞儀檢測其表面分子，證明兩種細(xì)胞均為間充質(zhì)干細(xì)胞；通過茜素紅和油紅染色，證明兩種干細(xì)胞具有向成骨和成脂方向分化的潛能；細(xì)胞膜片包裹Ti復(fù)合HA的基因檢測結(jié)果顯示Col-I、Col-III和S100A4的表達(dá)上調(diào)，雖然不是所有的納米管形貌都促進(jìn)了表達(dá)的上調(diào)，但依然可以表明納米管形貌能夠促進(jìn)細(xì)胞膜片向牙周膜方向的分化；裸鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明，納米管形

13、貌能夠促進(jìn)復(fù)合膜片向牙周方向再生，其中在復(fù)合膜片/NT10/HA復(fù)合體表面有類似牙骨質(zhì)樣的結(jié)構(gòu)形成，而沒有支架材料 HA包裹的細(xì)胞膜片，在裸鼠體內(nèi)不能形成連續(xù)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并且復(fù)合細(xì)胞膜片較單一來源的細(xì)胞膜片再生能力更強(qiáng)。
　　結(jié)論：有限稀釋法分離培養(yǎng)的人PDLSCs和BMSCs具有多向分化和自我更新的潛能；納米管形貌能夠促進(jìn)復(fù)合膜片在裸鼠體內(nèi)的牙周異位再生。
　　本課題創(chuàng)新點：
　　1.首次將人來源的牙周膜干細(xì)胞和頜骨

14、間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用在納米管形貌上進(jìn)行研究，明確了不同管徑的納米管形貌對兩種干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　2.構(gòu)建了不同來源的復(fù)合細(xì)胞膜片在納米管周圍牙周再生的模型，并對多種來源和單一來源的細(xì)胞膜片的包裹方式相比較，明確了不同來源的復(fù)合膜片的組織再生能力更強(qiáng)。
　　3.通過裸鼠的體內(nèi)實驗明確了納米管形貌能夠促進(jìn)牙周組織的再生，并且確定出NT10的納米管形貌更接近天然的骨組織形態(tài)，為牙周再生提供了理論指導(dǎo)，并顯示出一定的應(yīng)用前景。