高熱量攝入對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響研究.pdf

1、探討代謝性疾病進(jìn)展過程中趨化因子對(duì)MSCs的作用及機(jī)制，可以加深我們對(duì)代謝性疾病的認(rèn)識(shí)。阿司匹林可以改善機(jī)體的炎癥環(huán)境，因此明確炎癥環(huán)境的改善對(duì)MSCs生物學(xué)特性的影響，將為深入了解代謝性疾病的發(fā)病機(jī)理提供新思路，為臨床診療工作提供新的理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.明確高熱量攝入對(duì)大鼠骨髓來源MSCs(BMSCs)生物學(xué)特性的影響
　　2.探討趨化因子CINC-3對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響及其調(diào)控機(jī)制
　

2、　3.明確阿司匹林對(duì)高熱量攝入誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境的改善及BMSCs生物學(xué)特性的作用
　　研究方法:
　　1.不同飲食模式喂養(yǎng)的Sprague Dawley(SD)大鼠模型的建立與鑒定
　　6周齡的SD大鼠隨機(jī)分為三組，正常飲食組(Normal Diet，ND)大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，高熱量飲食組（High Fat Diet，HFD）大鼠飼喂定制的高熱量飼料（基礎(chǔ)飼料60％，添加10％蔗糖、20％豬油、10％蛋黃粉），重建飲食組(

3、2GC)大鼠首先飼喂高熱量飼料2個(gè)月后，改喂基礎(chǔ)飼料，在喂養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)大鼠體重、體長(zhǎng)及血清總膽固醇、空腹血糖、胰島素耐量等生理生化指標(biāo)，同時(shí)切取大鼠肝臟、脂肪及骨組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
　　2.高熱量攝入對(duì)大鼠BMSCs生物學(xué)特性的影響
　　采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取大鼠BMSCs，倒置顯微鏡下觀察不同飲食模式喂養(yǎng)的大鼠BMSCs的細(xì)胞形態(tài);通過MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力并通過Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀對(duì)各組細(xì)胞的周期

4、及凋亡水平進(jìn)行檢測(cè);利用transwell法檢測(cè)BMSCs的遷移能力;選用P3代大鼠BMSCs，分別向成脂成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化，通過組化染色及Real-time PCR檢測(cè)成脂成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)，明確高熱量攝入對(duì)BMSCs定向分化能力的影響;通過SA-β-Gal染色對(duì)不同飲食模式喂養(yǎng)的各組大鼠BMSCs老化程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用MitoSOXTM熒光染色檢測(cè)活細(xì)胞線粒體超氧化物含量，流式分析法檢測(cè)BMSCs過氧亞硝酸鹽含量，并利用Rea

5、l-time PCR檢測(cè)BMSCs端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT、組蛋白去乙?；窼IRT1的表達(dá)水平，探討高熱量攝入導(dǎo)致BMSCs老化程度增加的機(jī)制。
　　3.高熱量攝入誘導(dǎo)的趨化因子CINC-3對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的作用
　　不同飲食模式飼喂6個(gè)月大鼠，空腹12小時(shí)后，大鼠尾靜脈取血并分離血清，采用細(xì)胞因子抗體芯片RayBio(R) Rat Cytokine Antibody Array G-Series2檢測(cè)大鼠血清中相關(guān)細(xì)

6、胞因子含量，分析高熱量攝入對(duì)大鼠血清細(xì)胞因子的影響。
　　為探討高熱量攝入誘導(dǎo)的CINC-3對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的作用，在BMSCs體外培養(yǎng)基中添加CINC-3，研究方法同前，檢測(cè)BMSCs的增殖能力、細(xì)胞周期及凋亡、遷移能力、并對(duì)其老化及機(jī)制進(jìn)行探討。在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加CINC-3，不同時(shí)間點(diǎn)通過組化染色及Real-time PCR檢測(cè)成臘成骨分化標(biāo)志基因的表達(dá)，明確高熱量攝入誘導(dǎo)的CINC-3的增加對(duì)BMSCs定向分化能

7、力的影響。
　　4.高熱量攝入誘導(dǎo)的趨化因子CINC-3對(duì)BMSCs遷移及分化能力的作用機(jī)制
　　BMSCs體外培養(yǎng)過程中加入不同濃度的CINC-3進(jìn)行刺激，通過Western Blot和G-LISA的方法檢測(cè)相關(guān)蛋白ELMO1及Active Rac1的表達(dá);并通過功能性封閉抗體Anti-CINC-3 antibody進(jìn)一步驗(yàn)證高熱量攝入誘導(dǎo)的CINC-3對(duì)ELMO1及Active Rac1的活化;通過MTS法檢測(cè)Activ

8、e Rac1的抑制劑NSC23766對(duì)BMSCs增殖能力的影響，并利用組化染色和Real-time PCR檢測(cè)成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá)，明確CINC-3抑制BMSCs成脂分化的作用機(jī)制;最后通過siRNA敲減實(shí)驗(yàn)，敲低BMSCs中ELMO1的表達(dá)，探討CINC-3影響B(tài)MSCs遷移能力的作用機(jī)制。
　　5.阿司匹林對(duì)改善高熱量攝入誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境及BMSCs生物學(xué)特性的作用研究
　　6周齡的SD大鼠隨機(jī)分為四組:ND組大鼠飼喂基

9、礎(chǔ)飼料，HFD組大鼠飼喂定制的高熱量飼料;2GC組大鼠首先飼喂高熱量飼料2個(gè)月后，改喂基礎(chǔ)飼料;重建飲食合并阿司匹林治療組(2GC+Aspirin)在飼喂高熱量飼料2個(gè)月后，改喂基礎(chǔ)飼料的同時(shí)添加阿司匹林進(jìn)行抗炎治療。在喂養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)大鼠生理生化指標(biāo)，并切取大鼠部分組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。采用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)上述四組大鼠飼喂6個(gè)月血清中細(xì)胞因子水平的變化;并對(duì)各組大鼠BMSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)，研究方法同前，探討阿司匹林對(duì)高

10、熱量攝入誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境的改善及對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.不同飲食模式喂養(yǎng)的SD大鼠模型的建立與鑒定
　　HFD組大鼠隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體型增大，體重和Lee's指數(shù)增加，血清總膽固醇、空腹血糖含量升高，且組織胰島素敏感性降低;2GC組大鼠在改變飲食后，血清總膽固醇迅速恢復(fù)正常，胰島素耐量在改變飲食后4個(gè)月(2G4C)恢復(fù)正常。HFD組大鼠喂養(yǎng)6個(gè)月(6MG)肝臟、脂肪及骨組織存在明顯的病理

11、學(xué)改變，肝臟組織表現(xiàn)明顯的脂肪變現(xiàn)象，腹腔大網(wǎng)膜處的脂肪組織細(xì)胞橫截面直徑增加，骨組織中破骨細(xì)胞數(shù)目增多;重建飲食組(2G4C)大鼠的組織器官病理學(xué)與正常飲食組(6MC)無明顯差異。
　　2.高熱量攝入對(duì)大鼠BMSCs生物學(xué)特性的影響
　　與6MC組BMSCs相比，6MG組大鼠BMSCs體外增殖能力降低，G0/G1期細(xì)胞比例增加，凋亡無明顯變化;2G4C組大鼠BMSCs增殖能力、細(xì)胞周期及凋亡水平無明顯差異。而6MG組和2G

12、4C組大鼠BMSCs體外遷移能力增加，成脂、成骨分化能力降低;BMSCs老化現(xiàn)象明顯，線粒體中超氧化物、過氧亞硝酸鹽含量增加，端粒酶催化亞基TERT、組蛋白去乙?；窼IRT1表達(dá)水平降低。
　　3.高熱量攝入誘導(dǎo)的趨化因子CINC-3對(duì)BMSCs生物學(xué)特性的作用
　　細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，6MG組大鼠血清中趨化因子CINC-3、CX3CL1、LIX的水平比6MC組高出20％以上;2G4C組大鼠血清中CINC-3、

13、LIX仍舊高于6MC組。ELISA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，2G4C組大鼠血清中CINC-3含量高于6MC組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體外添加CINC-3對(duì)BMSCs的增殖無顯著作用，但可促進(jìn)BMSCs的遷移和老化，并下調(diào)BMSCs成脂分化相關(guān)基因Cebpα和PPAR-γ的表達(dá)，抑制BMSCs成脂分化。
　　4.高熱量攝入誘導(dǎo)的趨化因子CINC-3對(duì)BMSCs遷移及分化能力的作用機(jī)制
　　體外添加CINC-3，BMSCs中趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)

14、導(dǎo)通路相關(guān)蛋白ELMO1及ActiveRac1的表達(dá)增加，Anti-CINC-3中和抗體可特異性抑制CINC-3誘導(dǎo)的BMSCs中ELMO1和Active Rac1的活化;體外添加Active Rac1的抑制劑NSC23766不影響B(tài)MSCs的增殖，但可在一定程度上逆轉(zhuǎn)Active Rac1的激活對(duì)BMSCs成脂分化的抑制;敲減ELMO1后BMSCs遷移能力降低。
　　5.阿司匹林對(duì)改善高熱量攝入誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境及BMSCs生物學(xué)特

15、性的作用研究
　　2GC+Aspirin組大鼠的體重、Lee's指數(shù)及空腹血糖一直維持在較穩(wěn)定水平，其血清中總膽固醇在改喂正常飲食并抗炎治療后1個(gè)月恢復(fù)正常;胰島素耐量在改喂正常飲食并抗炎治療后3個(gè)月恢復(fù)正常;2G4C+Aspirin組大鼠血清中絕大部分細(xì)胞因子恢復(fù)正常，CICN-3、IL-1α水平仍高于6MC組;2G4C+Aspirin組大鼠BMSCs成脂分化能力及老化程度雖未恢復(fù)正常，但較2G4C組有所改善。
　　研究結(jié)

16、論:
　　1.本研究構(gòu)建了高熱量飲食及重建飲食SD大鼠動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)大鼠重建飲食4個(gè)月(2G4C)后生理生化指標(biāo)恢復(fù)正常，但其BMSCs與正常飲食組(6MC) BMSCs相比，老化現(xiàn)象仍然明顯，遷移能力增加，成脂、成骨定向分化能力降低。同時(shí)，蛋白質(zhì)芯片及ELISA對(duì)大鼠血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2G4C組大鼠趨化因子CINC-3水平亦未恢復(fù)正常，提示高熱量攝入誘導(dǎo)大鼠血清CICN-3的升高可能與BMSCs生物學(xué)特性的變化有關(guān)。

17、r>　　2.體外添加CINC-3對(duì)BMSCs的增殖無顯著作用，但可促進(jìn)BMSCs的遷移和老化，并抑制BMSCs成脂分化。進(jìn)一步證實(shí)CINC-3與BMSCs生物學(xué)特性的相關(guān)性。
　　3.體外添加CINC-3可促進(jìn)Chemokine信號(hào)通路中ELMO1及Active Rac1的活化，而Anti-CINC-3中和抗體抑制其激活;敲減ELMO1降低BMSCs的遷移能力;體外添加Active Rac1的抑制劑NSC23766可在一定程度逆轉(zhuǎn)

18、Active Rac1的激活對(duì)BMSCs成脂分化的抑制。說明Chemokine信號(hào)通路中ELMO1和Active Rac1參與調(diào)控BMSCs的遷移及分化。
　　4.重建飲食同時(shí)添加阿司匹林治療組(2G4C+Aspirin)大鼠血清中絕大多數(shù)細(xì)胞因子均可恢復(fù)到正常水平，雖然趨化因子CINC-3未完全恢復(fù)正常，但其BMSCs老化程度及成脂分化能力均較2G4C組有所改善，說明阿司匹林可在一定程度上改善高熱量攝入誘導(dǎo)的炎癥環(huán)境及其對(duì)BMS