納洛酮對大鼠全腦缺血-再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：1960年Jemlings提出了缺血-再灌注損傷這一概念，后經(jīng)臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同種屬(人、兔、大鼠、狗、豚鼠、豬等)和各種組織器官(心、肝、腎、肺、腦、胃腸、肢體和皮膚等)都可以發(fā)生再灌注損傷。休克、多器官功能衰竭、急性心力衰竭、呼吸衰竭、腎功能衰竭等各種病理過程的發(fā)生，都有缺血一再灌注損傷的參與，因此探索缺血-再灌注損傷的特點(diǎn)、規(guī)律和發(fā)生機(jī)制，既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又避免或減輕缺血-再灌注損傷的發(fā)生，已成為當(dāng)今

2、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。 再灌注損傷是否出現(xiàn)及其嚴(yán)重程度，關(guān)鍵在于缺血時間的長短、側(cè)支循環(huán)的形成情況、對氧要求程度以及電解質(zhì)濃度。一般來說，對氧要求不高的組織器官不易誘發(fā)再灌注損傷。但腦對缺氧最敏感，主要依靠葡萄糖有氧氧化提供能量，缺血時間長可引起不可逆性損傷。故人們對腦缺血-再灌注損傷的研究提高了重視，并在多年的研究中發(fā)現(xiàn)腦缺血-再灌注損傷能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。 細(xì)胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及可塑性中有重要的作用，它可以清除多余的、

3、失去功能的細(xì)胞，確保正常發(fā)育生長，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但細(xì)胞凋亡的異常即凋亡失調(diào)不但不能起到對機(jī)體積極的防御功能，反而可以導(dǎo)致該“死”的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞，自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞)未死，不該“死”的細(xì)胞(如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞)死了，而使得一些疾病(如自身免疫性疾病、心肌缺血一再灌注損傷，老年性癡呆等)發(fā)生。凋亡失凋是當(dāng)今威脅人類健康許多重大疾病的發(fā)病機(jī)制之一。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程是人類防治這些疾病的新途徑之一。神經(jīng)保護(hù)劑在急性缺血性腦血管疾病治

4、療中具有重要作用，目前可以安全有效地應(yīng)用于臨床的藥物仍較少，尋找有效的神經(jīng)保護(hù)劑是醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。目前認(rèn)為，納洛酮作為內(nèi)源性阿片受體阻滯劑可以減輕腦缺血損傷，但有關(guān)納洛酮在腦缺血中的作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究用最新的流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測大鼠全腦缺血一再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量及Bcl-2，Bax蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，探討納洛酮可能存在的作用機(jī)制，為尋找有助于臨床應(yīng)用的神經(jīng)保護(hù)劑類藥物提供一些新的思路。 方法： 1

5、.動物與分組：選取健康成年雄性Wistar大鼠36只，體重在250克左右。隨機(jī)分為假手術(shù)組，對照組及治療組，治療組又按不同開始給藥時間點(diǎn)分為0h，6h，12h，24h四組。各組每個時間點(diǎn)隨機(jī)選取6只大鼠。 2.模型制作：采用大鼠四條血管阻斷方法(Pulsinelli-4VO法)制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠用10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉，電凝雙側(cè)椎動脈，次日夾閉兩側(cè)頸總動脈15分鐘，恢復(fù)再灌注。治療組于不同開

6、始時間點(diǎn)累積給藥(腹腔注射納洛酮2mg/kg)，并于48小時統(tǒng)一處死。對照組給予腹腔注射生理鹽水，假手術(shù)組不電凝雙側(cè)椎動脈，不夾閉兩側(cè)頸總動脈，不給予腹腔注射，兩組余與治療組處理相同。 3.標(biāo)本制作：于48小時點(diǎn)麻醉動物迅速斷頭取腦，將大腦于矢狀面切成兩半，分離每側(cè)大腦半球的海馬組織，并將其置于70％酒精中固定，放置4℃冰箱中低溫保存。 4.凋亡細(xì)胞觀察：采用流式細(xì)胞分析技術(shù)Flow Cytometry (Fcm)觀察海

7、馬區(qū)細(xì)胞凋亡的變化及Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)水平。 5.數(shù)據(jù)收集：用Fcm 分析組方圖顯示出亮熒光的死細(xì)胞峰和淡染的活細(xì)胞峰，對兩群細(xì)胞定量分析和計算死細(xì)胞的比率。 6.統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，利用spss12.0軟件分析，組間比較利用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦缺血一再灌注損傷。用神經(jīng)保護(hù)劑納洛酮治療可減少