MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在整體動物水平，研究MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注（MCAO/R）誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　1、慢病毒介導(dǎo)的MRTF-A（LV-MRTF-A）在大鼠腦皮層中表達(dá)的分布及時間相關(guān)性的研究：①30只 SPF級 SD大鼠隨機(jī)分為5組，以注射陰性慢病毒（NEG-LV）為對照組，其余4組分別腦室注射LV-MRTF-A1μl、2μl、4μl、5μl，于第5d取全腦做石蠟切片，用激光共聚焦顯微鏡觀

2、察 MRTF-A表達(dá)；②取腦室注射4μl LV-MRTF-A5d的腦組織，激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠腦皮層不同部位MRTF-A表達(dá)；③36只SPF級SD大鼠隨機(jī)分為6組，腦室注射LV-MRTF-A后，分別于1d、3d、5d、7d、9d取全腦組織做石蠟切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各組腦皮層中MRTF-A表達(dá)。
　　2、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響：84只SPF級SD大鼠隨機(jī)分成3組：對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。對照

3、組與模型組分別腦室注射4μl NEG-LV；實(shí)驗(yàn)組腦室注射4μl LV-MRTF-A。腦室注射4天后，實(shí)驗(yàn)組與模型組分別構(gòu)建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h、MCAO2h/R48h、MCAO2h/R72h），用Longa’s法進(jìn)行神經(jīng)功能評分；用TTC染色評價腦梗塞體積；用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　3、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制：54只SPF級SD大鼠隨機(jī)分成3組：對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。

4、對照組與模型組分別腦室注射4μl NEG-LV；實(shí)驗(yàn)組腦室注射4μl LV-MRTF-A。腦室注射4天后，實(shí)驗(yàn)組與模型組分別構(gòu)建缺血再灌注模型（MCAO2h/R24h），用Real-time PCR檢測腦皮層中MRTF-A、caspase3及Mcl-1 mRNA表達(dá)；用Western blot檢測腦皮層中MRTF-A、CC3及 Mcl-1蛋白表達(dá)；用免疫熒光法檢測腦皮層細(xì)胞色素 C、Apaf-1、CC3、Mcl-1表達(dá)。
　　結(jié)果

5、：
　　1、LV-MRTF-A在大鼠腦皮層感染劑量研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦室注射不同劑量LV-MRTF-A5d后，1μl和2μl組MRTF-A表達(dá)較低，與2μl組對比，4μl和5μl組 MRTF-A表達(dá)明顯增加，且兩組表達(dá)無差異；LV-MRTF-A在大鼠腦皮層中分布研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A5d后，MRTF-A在腦皮層中廣泛表達(dá)，以注射點(diǎn)及其四周表達(dá)最高，注射點(diǎn)遠(yuǎn)端表達(dá)量逐漸下降；LV-MRTF-A在大鼠腦皮層中感染

6、時間研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A后，1d、3d有少量MRTF-A表達(dá)，5d、7d MRTF-A表達(dá)相比3d呈明顯上升趨勢，9d表達(dá)量相比7d降低。
　　2、MRTF-A對大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響研究發(fā)現(xiàn)：模型組神經(jīng)功能評分及腦梗死體積與對照組相比有顯著性差異（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)功能評分及腦梗死體積與模型組的同一再灌注時間點(diǎn)組比較，均顯著減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01）；

7、TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡率表明，與對照組比較，模型組凋亡率明顯增加（P＜0.05或 P＜0.01），且隨著再灌注時間延長，凋亡率呈逐漸下降趨勢。實(shí)驗(yàn)組與模型組的同一再灌注時間點(diǎn)對比，細(xì)胞凋亡率均顯著下降，且具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3、MRTF-A抗大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)：大鼠腦室注射4μl LV-MRTF-A后，大鼠腦皮層中MRTF-A mRNA及蛋白表達(dá)顯著上升。Real-time

8、 PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組caspase-3 mRNA表達(dá)明顯增加，Mcl-1 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。與模型組對比，實(shí)驗(yàn)組caspase-3 mRNA表達(dá)明顯下降，Mcl-1mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組CC3蛋白表達(dá)明顯增加，Mcl-1蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。與模型組對比，實(shí)驗(yàn)組 CC3蛋白表達(dá)明顯下降，Mcl-1蛋白表達(dá)明顯增加（P＜

9、0.01）；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：MCAO2h/R24h誘導(dǎo)cyt C與Apaf-1高表達(dá)，且兩者表達(dá)交集區(qū)域范圍廣，CC3表達(dá)明顯增加，Mcl-1表達(dá)明顯下降。腦室注射MRTF-A后，cyt C與Apaf-1表達(dá)及交集區(qū)域均明顯減少；CC3表達(dá)明顯下降, Mcl-1表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1、LV-MRTF-A最佳注射劑量為4μl，LV-MRTF-A最強(qiáng)表達(dá)時段為注射后第5d-7d，且以注射點(diǎn)為 LV-MRTF