肝細(xì)胞癌中DEK基因啟動子甲基化研究.pdf

1、目的:DEK蛋白最初被發(fā)現(xiàn)于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中，它與CAN形成DEK-CAN融合蛋白。DEK在多種腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)，顯現(xiàn)出與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系。DEK基因在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞，提示DEK可能在HCC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。我們希望通過研究DEK基因啟動子區(qū)域在HCC細(xì)胞系中的甲基化水平與DEK表達(dá)量之

2、間的關(guān)系來闡明DEK基因在HCC中表達(dá)上調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
　　方法:選取七種HCC細(xì)胞系，以一種正常肝細(xì)胞系和一例正常肝組織作為對照，通過熒光定量PCR和Western blotting方法，分別檢測DEK在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量。應(yīng)用亞硫酸氫鈉-基因組測序法(Bisulfite genome-sequencing，BGS)測定DEK基因啟動子區(qū)域的甲基化水平，并獲得了詳細(xì)的甲基化位點。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對DEK啟動子

3、區(qū)域進(jìn)行分析，確定其可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。應(yīng)用PCR法擴(kuò)增了位于DEK基因啟動子區(qū)域的4個片段，分別將用甲基化酶處理過和未處理過的各片段插入熒光素酶報告基因表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測熒光素酶表達(dá)活性。
　　結(jié)果:DEK mRNA和蛋白表達(dá)水平在HCC細(xì)胞中均上調(diào)。BGS法檢測結(jié)果顯示，DEK基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平在HCC細(xì)胞系中明顯下調(diào)，正常肝細(xì)胞和正常肝組織的DEK基因啟動子區(qū)域甲基化水平較高，并且集

4、中在啟動子下游，緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域。通過分析DEK基因啟動子區(qū)域CpG島上的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)許多甲基化的位點恰好位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列上。熒光素酶表達(dá)活性檢測結(jié)果顯示，甲基化能夠普遍抑制DEK啟動子的活性;在未被甲基化處理的片段中，CpG島的近轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(CpG2-1)活性明顯高于其上游啟動子片段(CpGl)活性，而CpG2-1片段中只保留集中發(fā)生甲基化的緊鄰轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(CpG2-2)啟動子活性沒有明顯降低。
　　結(jié)論:HCC中D