風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白細(xì)胞融合活性位點(diǎn)的定位及衣殼蛋白對融合活性的影響.pdf

1、風(fēng)疹病毒（rubella virus，RV）是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人類是RV的唯一自然宿主。RV自然感染僅引起輕微的臨床癥狀，許多感染是無癥狀的亞臨床感染。一般于感染后16～20天內(nèi)出現(xiàn)皮疹，首先于面部出現(xiàn)，然后擴(kuò)散到軀干及四肢，其余癥狀還包括低熱、淋巴結(jié)腫大和咽痛。RV感染的并發(fā)癥以關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)痛最為常見，而且多發(fā)生于婦女。 RV引起的主要問題是它的致畸性，即母親孕期感染RV會導(dǎo)致胎兒發(fā)生先天性風(fēng)疹綜合征（con

2、genital rubella syndrome，CRS）。CRS的臨床表現(xiàn)多種多樣，其中耳聾最為常見，還包括心臟疾病、精神發(fā)育遲滯和眼部疾患如白內(nèi)障和青光眼。妊娠期間母親感染RV越早，胎兒損害越嚴(yán)重。 成熟的RV病毒顆粒是直徑為60nm的球形，核心是衣殼蛋白和單股正鏈基因組40S RNA組成的核衣殼，其外包繞脂質(zhì)雙層膜，膜上是長度為5～6nm的刺突--由糖蛋白E2和E1組成。衣殼蛋白（capsid protein，CP）是非糖

3、基化的磷酸蛋白，靠二硫鍵形成同源二聚體。CP富含脯氨酸和精氨酸，與RV基因組RNA的結(jié)合有關(guān)。 包膜糖蛋白E1和E2都是Ⅰ型膜糖蛋白，在病毒表面以異二聚體的形式存在。E1和E2都含有一段跨膜區(qū)（TM），長度分別為22和39個氨基酸。在E2中，TM之后是一段帶正電荷的七氨基酸序列和E1的20個氨基酸信號肽。E1和E2都富含半胱氨酸殘基，E1胞外功能區(qū)的20個半胱氨酸都形成二硫鍵，E2總共含有14個半胱氨酸殘基。E1有3個N-聯(lián)糖基

4、化位點(diǎn)，E2的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)數(shù)目在不同的毒株間有差別，除N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)外，E2還含有O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。 E1和E2的功能研究較為廣泛，單克隆抗體研究發(fā)現(xiàn)E1至少含有6個不重復(fù)的抗原位點(diǎn)，與血凝和中和活性有關(guān)。E1還與病毒和細(xì)胞的吸附有關(guān)，是主要的表面蛋白。E2的功能研究顯得較為困難，因?yàn)樗cE1結(jié)合后，幾乎不暴露在細(xì)胞表面，也就無法用單克隆抗體識別其抗原位點(diǎn)。但是，E2也含有部分血凝表位和中和表位，還有株特異性表位。

5、 細(xì)胞融合是包括RV在內(nèi)的許多有膜病毒侵入細(xì)胞、復(fù)制、釋放、傳播、致病的重要生物過程，也是細(xì)胞間信息傳遞的重要步驟。RV入侵細(xì)胞的途徑還沒有弄清楚，但是有證據(jù)表明是通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。Katow和Sugiura發(fā)現(xiàn)pH在6．0以下時(shí)，E1和E2會發(fā)生構(gòu)象改變，這種改變有利于病毒包膜與內(nèi)含體膜的融合。 若能弄清RV引起細(xì)胞融合的機(jī)制，從而改變RV的基因組，改變它的表達(dá)產(chǎn)物和生物學(xué)活性，就可以消除或降低RV的致畸性；也可以通過改

6、變其侵入細(xì)胞或復(fù)制的特性來消除或減少胎兒感染的危險(xiǎn)性；還可以為研制更安全有效的RV新型基因工程疫苗（基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等）和特異性抗病毒的多肽類藥物奠定基礎(chǔ)。 細(xì)胞融合由位于細(xì)胞表面的蛋白引起，因此細(xì)胞融合功能的檢測需要所研究的蛋白能夠在細(xì)胞表面表達(dá)。RV E2的信號肽在病毒結(jié)構(gòu)蛋白的加工及轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用，為了使所表達(dá)蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)正確加工及順利轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面，本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBSK-SPE2E1，即將

7、E2的信號肽序列、E2和E1的全基因序列克隆到載體pBluescriptⅡ SK+的EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)之間。然后利用定點(diǎn)突變和同源重組的方法，構(gòu)建一系列突變體，Giemsa染色和指示基因法檢測它們的細(xì)胞融合活性變化，流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)效率，Western blot檢測總表達(dá)量的改變，血吸附實(shí)驗(yàn)檢測受體識別活性，分析突變位點(diǎn)對RV包膜糖蛋白細(xì)胞融合活性的影響，以確定具有細(xì)胞融合活性的位點(diǎn)。本研究還構(gòu)建了

8、RV CP的重組載體pBSK-C，并檢測CP對包膜糖蛋白細(xì)胞融合活性的影響。 一、E1胞外功能區(qū)二硫鍵對RV細(xì)胞融合活性的影響 RV E1包膜糖蛋白胞外功能區(qū)含有20個半胱氨酸殘基，而且都形成分子內(nèi)二硫鍵。本研究利用定點(diǎn)突變和同源重組相結(jié)合的方法，將RV JR23株E1蛋白胞外功能區(qū)的20個半胱氨酸中的11個突變?yōu)槠渌被?，?gòu)建了11個突變體Cys2、Cys3、Cys4、Cys5、Cys6、Cys8、Cys9、Cys

9、12、Cys13、Cys17和Cys20，每個突變體去除E1的1個二硫鍵，檢測單個二硫鍵的消失對E1細(xì)胞融合活性的影響。 二、E2中半胱氨酸對RV細(xì)胞融合活性的影響 RV包膜糖蛋白E2中含有14個半胱氨酸，其中12個位于胞外功能區(qū)，1個位于跨膜區(qū)，1個位于胞質(zhì)區(qū)。本研究利用定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組的方法，用突變的寡核苷酸為引物，構(gòu)建了14個E2的半胱氨酸突變體，每個突變體去除一個半胱氨酸，這些突變體分別為C69T、C82S

10、、C91S、C124G、C132A、C139P、C152G、C157R、C172A、C196G、C207G、C219T、C255W和C259G。 三、E1關(guān)鍵氨基酸突變體對細(xì)胞融合活性的影響 E1胞外功能區(qū)的半胱氨酸突變分析顯示，第3、4和13位半胱氨酸突變之后，在細(xì)胞表面表達(dá)量與野毒株相比沒有降低，但是卻檢測不到融合活性，這3個半胱氨酸所形成的二硫鍵集中在E1的213～285位氨基酸之間，而這一段區(qū)域富含RV中和表位和

11、血凝抑制表位，具有較重要的生物學(xué)活性，我們在此區(qū)域選擇了一些保守的或結(jié)構(gòu)上比較特殊的氨基酸，構(gòu)建了12個突變體H226Q、H238Q、R252S、P253T、R254Q、R256T、L257T、D259G、D261G、P263A、R266Q和P269S。 四、衣殼蛋白CP對RV包膜糖蛋白細(xì)胞融合活性的影響 RV衣殼蛋白CP在病毒復(fù)制、組裝及感染過程中都有作用，本研究檢測其對包膜糖蛋白的細(xì)胞融合活性的影響。RV JR23株

12、感染BHK21細(xì)胞6天后提取病毒RNA，利用上游引物C1和下游引物C2反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增C基因，引物中分別含有EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增的片斷酶切后，與經(jīng)相同酶切的載體pBluescriptⅡ SK+片斷連接，測序證實(shí)成功構(gòu)建重組載體pBSK-C。將pBSK-C單獨(dú)轉(zhuǎn)染至BHK21細(xì)胞中，間接免疫熒光（IFA）檢測表達(dá)蛋白活性，結(jié)果在核周區(qū)可見到較強(qiáng)的熒光。將pBSK-C與RV糖蛋白重組質(zhì)粒pBSK-SPE2E1共同轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，

13、Giemsa染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞幾乎全部發(fā)生融合，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pBSK-SPE2E1的細(xì)胞相比，細(xì)胞融合灶數(shù)量增多而且每個融合灶的細(xì)胞核數(shù)量增加，用指示基因法定量細(xì)胞融合顯示共轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞融合為糖蛋白單獨(dú)轉(zhuǎn)染的137％?？梢奀P可以促進(jìn)RV包膜糖蛋白的細(xì)胞融合活性。 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論： RV包膜糖蛋白E1胞外功能區(qū)的10個二硫鍵都是維持E1細(xì)胞融合活性不可缺少的，其中C（5）-C（8）影響E1和E2的相互作用。

14、 RV包膜糖蛋白E2序列中的14個半胱氨酸中，胞外區(qū)有1個半胱氨酸及胞質(zhì)區(qū)的唯一1個半胱氨酸對E1的細(xì)胞融合活性沒有影響，其余12個都對E1的細(xì)胞融合功能有重要作用，它們可能通過二硫鍵的形成間接對其產(chǎn)生影響。 RV E1的213～285aa，區(qū)域含有一些重要的細(xì)胞融合活性位點(diǎn)，是維持RV融合活性的關(guān)鍵氨基酸，如H238、P253、L257、D259G、D261、R266和P269。 成功構(gòu)建了RV CP的重組載體，并在