IL-18-EGFc融合蛋白抗腫瘤活性的細胞及動物實驗.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建IL-18-EGFc融合基因并將其與表達載體pET12a(+)連接，轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達產(chǎn)物經(jīng)分子凝膠層析S-100純化、離子交換層析DEAE-SFF純化復(fù)性后得到具有生物學(xué)活性的IL-18-EGFc蛋白，并研究了針對表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)高表達的人表皮癌A431的荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。
　　

2、 方法：
　　 1．IL-18-EGFc原核表達載體的構(gòu)建和表達前期構(gòu)建的pET32a(+)-EGFc-IL-18質(zhì)粒作為模板，設(shè)計引物分別擴增EGFc端序列和IL-18序列，然后以上述PCR產(chǎn)物為模板擴增IL-18-EGFc全長序列，目的基因經(jīng)酶切后與原核表達載體pET12a(+)連接，構(gòu)建新型表達載體pET12a(+)-IL-18-EGFc，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定和測序確定序列正確。轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，以0

3、.5mmol終濃度IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳分析表達情況和Westernblot鑒定。
　　 2．IL-18-EGFc的純化復(fù)性及體外生物學(xué)測定表達產(chǎn)物主要以包涵體形式表達，將包涵體洗滌后溶于8M尿素中，經(jīng)分子凝膠層析S-100純化、離子交換層析DEAE-SFF純化復(fù)性后，體外刺激人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞(NK-92MI)，以IFN-γELISA試劑盒檢測IFN-γ的表達情況。
　　 3．IL-

4、18-EGFc的體內(nèi)生物學(xué)鑒定收集足夠量的人表皮癌A431細胞，構(gòu)建人表皮癌A431Balb/c荷瘤小鼠腫瘤模型，隨機分成三個治療組：IL-18-EGFc組、IL-18組和NS組，結(jié)合經(jīng)放射線處理的NK-92MI細胞共同進行瘤周注射治療。IL-18-EGFc組治療濃度為25ug/只；IL-18組治療濃度為1ug/只；NS組治療濃度為0.1ml/只。監(jiān)測腫瘤生長曲線；治療結(jié)束后，應(yīng)用流式細胞術(shù)進行細胞凋亡和周期的檢測，同時進行病理組織切片

5、的觀察。
　　 結(jié)果：
　　 1．成功構(gòu)建pET12a(+)-IL-18-EGFc原核表達載體并誘導(dǎo)表達目的蛋白經(jīng)限制性酶切鑒定及測序分析表明原核表達載體pET12a(+)-IL-18-EGFc與設(shè)計相符；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能在工程菌EcoliRosetta(DE3)中高效表達，目的條帶分子量大小為21kDa，且目的條帶能被IL-18mAb特異性識別。
　　 2．成功純化復(fù)性得到具有生物學(xué)活性的IL-18-EGFc

6、蛋白目的蛋白經(jīng)分子凝膠層析S-100純化、離子交換層析DEAE-SFF純化復(fù)性后，得到純度95％的目的蛋白，刺激NK-92MI細胞，能夠產(chǎn)生IFN-γ，并具有劑量依賴性。
　　 3．IL-18-EGFc蛋白具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。相對于對照組生理鹽水和rhIL-18，IL-18-EGFc組的抑瘤率達到69.0％，顯著高于對照組；腫瘤凋亡結(jié)果顯示IL-18-EGFc組、IL-18組和NS組凋亡率分別為59.27±1.87％(P＜

7、0.01，相對于NS組)，36.32±1.08％(P＜0.05，相對于NS組)和19.44±1.02％。IL-18-EGFc組和rhIL-18組也存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。IL-18-EGFc組細胞周期明顯被阻滯在G1期(P＜0.05，相對于NS組)，S期細胞減少(P＜0.05，相對于NS組)。病理切片觀察也提示了凋亡壞死情況的增加。
　　 結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建了原核表達載體pET12a(+)-IL-18-EGF