饑餓小鼠肝臟中eIF4EBP3的功能及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞在面臨外界壓力時(shí),作出快速響應(yīng)以避免損傷和死亡是非常重要的。翻譯調(diào)控通過調(diào)控蛋白的表達(dá),是細(xì)胞對(duì)各種環(huán)境壓力作出快速的響應(yīng)的一種方式。其中,翻譯起始是真核生物基因表達(dá)調(diào)控中一個(gè)重要的階段,而翻譯起始的關(guān)鍵調(diào)控步驟是翻譯起始復(fù)合物的形成。
　　“饑餓”是研究能量代謝及真核翻譯起始調(diào)控機(jī)制的一個(gè)很好的模型。時(shí)常有一些饑餓相關(guān)的基因,最終證實(shí)是代謝調(diào)控相關(guān)基因。饑餓狀態(tài)下為了節(jié)約能量,肝臟中蛋白合成速率明顯受抑制,這與功能型翻譯起始

2、復(fù)合物量的降低相關(guān)。翻譯起始復(fù)合物eIF4F(eukaryotic initiation factor4F)中eIF4E(eukaryotic initiation factor4E)與mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合是該階段的核心。而eIF4E結(jié)合蛋白(eIF4E binding proteins,4E-BPs)正是通過與eIF4E的相互作用而調(diào)控翻譯起始過程,進(jìn)而調(diào)控翻譯的速率。4E-BPs抑制翻譯起始調(diào)控的方式主要有自身磷酸化和競爭性

3、與eIF4E相結(jié)合阻止eIF4F復(fù)合物的形成。
　　已有研究報(bào)道,在饑餓大鼠中,肝臟翻譯速率下降,結(jié)合的4E-BP1并沒有增加,但eIF4E結(jié)合的elF4G量卻顯著減少。eIF4E與eIF4G的結(jié)合是真核翻譯起始復(fù)合物eIF4F形成的核心,在此過程中,應(yīng)有其他調(diào)控因子參與才能解釋翻譯速率的降低。翻譯起始的調(diào)控是翻譯速率的調(diào)控的重要階段,且需要大量的真核翻譯起始因子的協(xié)同作用才能完成。目前,對(duì)于饑餓小鼠肝臟中翻譯速率降低的機(jī)制,并沒

4、有給出很好的解釋。對(duì)此方向的深入研究不僅可以進(jìn)一步闡明饑餓下肝臟翻譯速率降低的分子機(jī)制,還可豐富人們對(duì)發(fā)育過程中真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。深入了解饑餓小鼠肝臟翻譯調(diào)控的機(jī)制,具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值:一方面可以為研究能量代謝提供理論依據(jù);另一方面,也將有助于糖代謝和脂代謝相關(guān)疾病的新的治療靶點(diǎn)及治療方法的研究。
　　為了進(jìn)一步深入研究饑餓狀態(tài)下肝臟中蛋白合成受抑制的分子機(jī)制,構(gòu)建了饑餓小鼠肝臟模型,提取了小鼠總RNA,并對(duì)其進(jìn)

5、行了mRNA的純化。并進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片檢測和數(shù)據(jù)處理,通過IPA(Ingenuity Pathway Analysis)平臺(tái)構(gòu)建了饑餓狀態(tài)下小鼠肝臟的轉(zhuǎn)錄控制網(wǎng)絡(luò)。通過對(duì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)以若干核心轉(zhuǎn)錄因子為核心,控制著一批基因的表達(dá)量發(fā)生改變。然而,存在大量的未與該控制網(wǎng)絡(luò)相連接的孤立分子,提示此類分子的轉(zhuǎn)錄控制研究尚未明了。對(duì)此類孤立分子,綜合表達(dá)信號(hào)檢測可信度、表達(dá)量變化程度、已有研究的深入程度等方面因素考慮,選擇基于IP

6、A構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,屬于無上下游調(diào)控關(guān)系的孤立分子,而且罕有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)其功能的ANKHD1分子。因此,研究該基因的上下游調(diào)控關(guān)系可將該孤立分子與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)連接,并進(jìn)一步揭示該分子在能量不足時(shí)表達(dá)量改變的原因及其結(jié)果。在進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí),發(fā)現(xiàn)代表ANKHD1分子的探針集其反映的是eIF4EBP3表達(dá)量變化。
　　eIF4EBP3是4E-BPs家族的一員,其可競爭性與eIF4E相結(jié)合,阻止翻譯起始復(fù)合物eIF4EF的形成從而調(diào)控翻譯的起始

7、。4E-BPs抑制翻譯起始調(diào)控的方式主要有自身磷酸化和競爭性與eIF4E相結(jié)合阻止eIF4F復(fù)合物的形成。目前,對(duì)饑餓小鼠肝臟中,eIF4EBP3的調(diào)控并沒有很好的闡述。本研究發(fā)現(xiàn),在饑餓小鼠肝臟中代表eIF4EBP3的探針集表達(dá)量顯著上升,進(jìn)一步通過檢測mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量證實(shí)其確實(shí)表達(dá)量上調(diào)。通過文獻(xiàn)調(diào)研,對(duì)eIF4EBP3在饑餓小鼠肝臟中表達(dá)上調(diào)的調(diào)控機(jī)制提出了假設(shè):肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α,Hepatocyte nu

8、clear factor-4α;NR2A1)是eIF4EBP3的轉(zhuǎn)錄因子,并且HNF4α對(duì)eIF4EBP3轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控需要過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α(PGC-1α,peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α)的輔助。肝細(xì)胞核因子4α是肝臟中重要轉(zhuǎn)錄因子,其調(diào)控肝臟中大多數(shù)基因的表達(dá)。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α作為轉(zhuǎn)錄共激活因子,其在

9、肝臟中調(diào)控糖異生相關(guān)的基因表達(dá),其在調(diào)控過程中需要HNF4α。通過m7-GTP-pull-down技術(shù),發(fā)現(xiàn)eIF4EBP3在饑餓小鼠肝臟中,其結(jié)合更多的eIF4E,而其家族其他成員(eIF4EBP1和eIF4EBP2)結(jié)合的eIF4E的量并沒有顯著增加。根據(jù)假設(shè),分別構(gòu)建了eIF4EBP3啟動(dòng)子的全長、突變體、敲除體和截短體。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),證實(shí)了在eIF4EBP3啟動(dòng)子的上游確實(shí)存在著HNF4α的順式轉(zhuǎn)錄元件。同時(shí)通過Ch

10、IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在eIF4EBP3啟動(dòng)子與HNF4α存在相互作用,說明HNF4α是eIF4EBP3的轉(zhuǎn)錄激活因子。構(gòu)建HNF4α和PGC-1α的表達(dá)載體,并與eIF4EBP3表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染,借助熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了eIF4EBP3的上調(diào)由PGC-1α和HNF4α共同調(diào)控。
　　上述結(jié)果表明:饑餓小鼠肝臟中,eIF4EBP3表達(dá)上調(diào),且eIF4E結(jié)合更多的eIF4EBP3,部分解釋了eIF4E結(jié)合的eIF4G減少的原因。HNF4