C-EBPβ調控microRNAs對食管鱗癌的影響及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　食管癌是人類常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)生率和高致死率的特征。食管癌主要分為兩類:食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)與食管鱗癌(esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)。其中，食管鱗癌是我國食管癌的主要組織學類型。目前食管癌的療效和預后很差，5年總體生存率僅為15％～25％。因此，研究其發(fā)病機制，尋找早期診斷及治療的靶點具有重要意義。
　　

2、食管鱗癌是上皮來源的一類惡性腫瘤，其高侵襲性和高轉移率是難以有效治療的主要原因，不少患者經食管癌切除術后常發(fā)生轉移與復發(fā)。目前已證實，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是腫瘤發(fā)生浸潤和轉移的起始步驟，與預后不良密切相關。目前食管癌發(fā)生EMT的機制尚不十分清楚。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種轉錄因子均可參與調節(jié)EMT進程，如β-catenin、ZEB1、ZEB2、snail、slug、 twis

3、t等。然而在不同類型的腫瘤中，調節(jié)EMT的關鍵因子差異很大。因此，尋找特異性調控食管癌EMT和轉移的關鍵分子顯得尤為重要。
　　轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白beta(CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBPβ)也稱作核因子白細胞介素-6(nuclear factor for IL-6，NF-IL6)，能調節(jié)細胞增殖與分化，參與炎癥反應、脂肪發(fā)生和腫瘤發(fā)生等重要生命活動。C/EBPβ

4、mRNA通過核糖體跳躍機制可選擇性翻譯成3種蛋白異構體:LAP1(Liver-enrichedtranscriptional activator protein)、LAP2和LIP(Liver-enriched transcriptional inhibitoryprotein)。LAP1和LAP2通常可作為轉錄激活因子，而LIP通常是轉錄抑制因子。近年研究表明，C/EBPβ的表達失調與多種腫瘤惡化密切相關，如膠質瘤、Wilms瘤、腎細

5、胞瘤、卵巢癌等。將過表達C/EBPβ LAP2蛋白的重組逆轉錄病毒感染人乳腺上皮MCF10A細胞可誘發(fā)EMT與侵襲表型。然而，C/EBPβ LAP2以何種機制啟動EMT以及C/EBPβ是否參與食管癌細胞EMT等問題有待研究。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是最近發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展等病理生理進程中發(fā)揮重要作用。已有研究證實，miR-203是一種抑癌基因樣的miRNA分子，在多種腫瘤中具有抑制EM

6、T和轉移的功能。miR-203在腫瘤中的低表達具有普遍性，目前已有多個研究小組在食管癌組織中觀察到miR-203基因的表達降低。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織與遠癌組織中miR-203啟動子區(qū)CpG島均處于非甲基化狀態(tài)，提示食管癌鱗中miR-203的表達下調并非由DNA甲基化狀態(tài)改變所引起。因此，miR-203在食管鱗癌中表達下降的機制仍有待研究。利用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-203基因啟動子區(qū)具有兩個保守的C/EBPβ結合位點，提

7、示miR-203可能受到C/EBPβ的調控。既往研究表明，C/EBPβ對下游靶基因可發(fā)揮轉錄激活和轉錄抑制的雙重作用，那么C/EBPβ將以何種方式調控miR-203的表達及相應機制是什么？另外，C/EBPβ是否通過調控miR-203參與食管癌EMT與轉移進程？
　　除EMT之外，腫瘤細胞的異常增殖與凋亡也是腫瘤惡化的重要生物學特征。細胞增殖和凋亡平衡失調是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象。以往的研究表明，C/EBPβ參與調控多種腫瘤細

8、胞如肝癌、膠質瘤及多發(fā)性骨髓瘤等的增殖與凋亡進程。然而，C/EBPβ是否影響食管癌細胞增殖和凋亡尚不清楚。研究報道，miR-146b與腫瘤細胞的增殖與凋亡相關。在食管癌中，miR-146b是一種癌基因樣的miRNA。miRNA表達譜分析顯示，miR-146b在食管癌組織中高表達并與患者總體生存率差相關。然而，miR-146b在食管癌細胞增殖、凋亡中的功能以及miR-146b在食管癌組織中表達上調的具體機制有待研究。生物信息學分析結果顯示

9、，miR-146b基因啟動子區(qū)具有兩個保守的C/EBPβ結合位點，提示miR-146b可能受到C/EBPβ的調控。然而，C/EBPβ調控miR-146b的方式及具體機制是什么？此外，C/EBPβ是否通過調控miR-146b的表達影響細胞增殖與凋亡進程？
　　本研究擬檢測食管鱗癌組織樣本中C/EBPβ的蛋白表達情況，并比較與淋巴結轉移等臨床病理參數(shù)的相關性以了解C/EBPβ的表達意義。體外實驗證實C/EBPβ是否參與食管鱗癌細胞EM

10、T、遷移、侵襲、增殖和凋亡等生物學行為以明確C/EBPβ的功能意義。進一步探討C/EBPβ對miR-203和miR-146b的調控作用以理解C/EBPβ參與腫瘤發(fā)生發(fā)展進程的分子機制。
　　研究方法與內容:
　　1.檢測C/EBPβ在食管鱗癌組織中的表達。
　　1.1采用Western Blot方法檢測了36對食管鱗癌組織以及配對遠癌組織中C/EBPβ的蛋白表達情況，并分析其表達與臨床病理參數(shù)的關系。
　　1.2

11、采用免疫熒光方法觀察食管鱗癌組織和遠癌組織中C/EBPβ與 vimentin的表達關系。
　　2.C/EBPβ在食管癌細胞EMT、遷移和侵襲中的功能。
　　2.1 EGF誘導食管癌細胞EMT模型的建立以及C/EBPβ表達變化。
　　EGF處理食管癌細胞株EC109和EC9706后，光學顯微鏡下觀察形態(tài)學變化;Western Blot檢測ZO-1，pan-cytokeratin，β-catenin，vimentin等EM

12、T標志基因以及C/EBPβ的蛋白表達;RT-qPCR法檢測C/EBPβ的mRNA表達水平。
　　2.2 C/EBPβ對食管癌細胞EMT、遷移和侵襲的影響。
　　2.2.1在EGF誘導食管癌細胞EMT模型中轉染C/EBPβ siRNA，Western Blot法檢測EMT標志蛋白表達，免疫熒光法觀察細胞形態(tài)學變化。
　　2.2.2將C/EBPβ真核表達質粒（pcDNA3-LAP1、pcDNA3-LAP2、pcDNA3-L

13、IP）轉染食管癌細胞，Western Blot法檢測EMT標志蛋白的表達，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　3.C/EBPβ LIP促進食管癌細胞EMT、遷移和侵襲的分子機制研究。
　　3.1 C/EBPβ LIP通過miR-203介導食管癌細胞EMT和促進細胞遷移及侵襲。
　　分別在EC109細胞中過表達pcDNA3-LIP真核表達質粒與化學合成的miR-203inhibitor，Western bl

14、ot檢測EMT標志蛋白表達。將pcDNA3-LIP真核表達質粒與miR-203 mimic共轉染食管癌EC109細胞后，transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。
　　3.2 C/EBPβ LIP抑制miR-203表達的分子機制。
　　3.2.1 C/EBPβ LIP對miR-203表達的影響。
　　EGF處理食管癌EC109和EC9706細胞24小時后RT-qPCR法檢測miR-203的表達情況。沉默C/EBPβ后

15、再用EGF處理24小時，RT-qPCR法檢測miR-203及下游靶基因的表達水平。正常培養(yǎng)條件下轉染不同劑量的pcDNA3-LIP真核表達質粒，24小時后RT-qPCR法檢測miR-203的表達水平。
　　3.2.2 ChIP、EMSA檢測miR-203基因轉錄起始位點上游調控區(qū)C/EBPβ結合情況。ChIP檢測EGF誘導后以及沉默C/EBPβ后miR-203基因調控區(qū)組蛋白修飾情況以觀察染色質凝聚狀態(tài)。
　　3.2.3雙熒

16、光素酶報告基因試驗檢測C/EBPβ LIP對miR-203轉錄活性的影響。
　　4.將食管癌細胞分別轉染C/EBPβ表達質粒與miR-146b mimics，EdU染色法檢測細胞增殖活性，流式細胞儀檢測細胞凋亡率以觀察C/EBPβ和miR-146b對食管癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　5.C/EBPβ對miR-146b的調控機制。
　　5.1 C/EBPβ對miR-146b基因表達的影響。
　　將pcDNA3-LA

17、P1、pcDNA3-LAP2和pcDNA3-LIP真核表達質粒以及陰性對照pcDNA3.1質粒轉染食管癌EC109細胞后RT-qPCR法檢測miR-146b表達。
　　5.2 ChIP方法檢測miR-146b基因轉錄起始位點上游調控區(qū)C/EBPβ結合情況。
　　5.3雙熒光素酶報告基因試驗檢測C/EBPβ LAP2對miR-146b轉錄活性的影響。
　　結果:
　　1.食管癌組織中C/EBPβ LIP表達上調及L

18、IP/LAP比例失衡與淋巴結轉移相關;C/EBPβ與vimentin具有共表達關系，提示C/EBPβ異常表達可能參與食管癌細胞EMT和侵襲轉移等進程。
　　2.在正常培養(yǎng)條件下，食管鱗癌細胞株EC109和EC9706呈現(xiàn)典型的鵝卵石狀多邊形的上皮樣細胞表型。EGF(50 ng/ml)誘導使細胞表型發(fā)生明顯改變，包括較為分散的生長模式，細胞呈現(xiàn)紡錘形的形態(tài)。與對照組比較，EGF顯著降低了ZO-1，pan-cytokeratin等上皮

19、標志蛋白表達水平，顯著增加了β-catenin，vimentin等間質標志蛋白表達水平，說明體外誘導食管癌細胞EMT的模型成功建立。在EGF誘導食管癌細胞EMT模型中，C/EBPβ蛋白與mRNA表達水平均顯著增加。
　　3.在EGF誘導食管癌細胞EMT模型中，干擾C/EBPβ能顯著上調ZO-1，pan-cytokeratin等上皮標志蛋白表達，下調β-catenin，vimentin等間質標志蛋白表達。過表C/EBPβ LIP能以

20、劑量依賴的方式顯著改變上述EMT標志蛋白表達水平。而過表達C/EBPβ LAP1和C/EBPβ LAP2不能改變EMT標志蛋白表達。提示C/EBPβ LIP對食管癌細胞發(fā)生EMT起關鍵作用。
　　4.與對照組比較，過表達C/EBPβ LIP組遷移和侵襲細胞數(shù)量明顯增加。提示C/EBPβ LIP能促進食管癌細胞遷移和侵襲。
　　5.在EGF誘導食管癌EMT模型中，沉默C/EBPβ可上調上皮標志蛋白ZO-1、pan-cytoke

21、ratin，下調間質標志蛋白β-catenin、vimentin，從而抑制EMT;在沉默C/EBPβ基礎上，加入miR-203 inhibitor能逆轉該效應，表現(xiàn)為下調上皮標志蛋白ZO-1、pan-cytokeratin，上調間質標志蛋白β-catenin、vimentin，從而促進EMT。說明C/EBPβLIP介導EMT的作用與miR-203相關。
　　6.過表達pcDNA3-LIP質粒能顯著增加細胞遷移和侵襲數(shù)量;在此基礎上

22、過表達miR-203 mimic后細胞遷移和侵襲數(shù)量減少，說明miR-203 mimic能夠逆轉C/EBPβ LIP促進細胞遷移和侵襲的效應。
　　7.EGF處理食管癌細胞后miR-203表達下調;干擾C/EBPβ能減弱EGF對miR-203表達的抑制作用并下調miR-203下游基因E2F1、BIRC5、snail、slug表達水平。在正常培養(yǎng)食管癌細胞中過表達C/EBPβ LIP能以劑量依賴的方式抑制miR-203表達水平。

23、r>　　8.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-203轉錄起始位點上游5KB范圍內的調控區(qū)域內有兩個C/EBPβ結合位點，分別位于-3628/-3615(203R1)和-3266/-3253(203R2)區(qū)域。ChIP實驗結果顯示，EGF處理后，C/EBPβ與203R1和203R2的結合均顯著增加。EMSA結果表明，EGF處理后C/EBPβ以LIP/LIP同源二聚體形式結合于203R1和203R2。過表達C/EBPβ LIP能顯著降低野生型20

24、3CNS-Luc的熒光素酶活性，但對突變型m203CNS-Luc無作用。
　　9.C/EBPβ LAP2與miR-146bmimic均能顯著提高食管癌細胞EdU染色陽性率，降低細胞凋亡率。
　　10.過表達C/EBPβ LAP2能以劑量依賴的方式增加miR-146b的表達水平;過表達C/EBPβ LAP1和C/EBPβ LIP對miR-146b的表達無影響。
　　11.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，miR-146b轉錄起始位點上

25、游5KB范圍內的調控區(qū)域內有兩個C/EBPβ結合位點，-1736/-1722(146R1)和-1492/-1478(146R2)區(qū)域。ChIP方法檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組（IgG組）比較，C/EBPβ與146R1和146R2結合均顯著高于對照組，其余兩個陰性區(qū)域對照Neg.ctrl1和Neg.ctrl2均無C/EBPβ富集情況。與陰性對照空載體pcDNA3.1質粒比較，過表達C/EBPβ LAP2能顯著提高野生型146CNS-Luc的熒光

26、素酶活性降低，但對突變型m146CNS-Luc無作用。
　　結論:
　　1.C/EBPβ LIP在食管鱗癌組織中高表達并與淋巴結轉移相關。
　　2.C/EBPβ LIP通過轉錄抑制miR-203表達發(fā)揮促進食管癌細胞EMT、遷移和侵襲的功能。
　　3.C/EBPβ LAP2通過轉錄激活miR-146b表達發(fā)揮促進食管癌細胞增殖、抑制細胞凋亡的功能。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)轉錄因子C/EBPβ在食管鱗癌組織中

27、異常表達，該轉錄因子具有重要功能和意義，參與了食管癌細胞EMT、侵襲、遷移、增殖和凋亡等生物學行為。C/EBPβ的不同異構體通過不同的轉錄水平調節(jié)機制，負調控與EMT、轉移相關的miR-203，正調控與增殖、凋亡相關的miR-146b，從而參與食管癌的發(fā)生與轉移過程。本研究揭示了同一個轉錄因子調控不同miRNA分子的生物學意義，拓展了我們對基因表達調控機制的認識，有助于深入理解食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機制并為食管鱗癌的診治提供依據(jù)，C/EBP