人肺癌細(xì)胞中抑癌蛋白PTEN下調(diào)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　目前，肺癌是全球腫瘤患者死亡的主要原因，其5年生存率僅為15％。探討肺癌發(fā)病機(jī)制，尋找有效治療靶分子成為研究肺癌的一個(gè)重要方向。現(xiàn)代基因?qū)W說認(rèn)為腫瘤發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因缺失密切相關(guān)。許多癌基因產(chǎn)物通過磷酸化激活細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、遷移、浸潤(rùn)及拮抗凋亡等方面促腫瘤的發(fā)生、發(fā)展；因此，特異性的去磷酸化的磷酸酶可能成為一個(gè)抑癌基因。既往研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)雙重特異性磷酸酶PTEN在包括肺癌及多種腫瘤中表達(dá)缺失或突變而功能喪失，

2、轉(zhuǎn)染野生型的PTEN可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，所以，已漸漸認(rèn)可PTEN為重要的抑癌基因。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道肺癌組織中PTEN缺失，但是并不清楚肺癌細(xì)胞中PTEN缺失的詳細(xì)分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1. Western blot方法檢測(cè)肺癌細(xì)胞和正常人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B PTEN蛋白的表達(dá)；用放線菌酮處理人肺腺癌細(xì)胞A549和正常人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B阻斷細(xì)胞翻譯后，Western blot方法檢測(cè)不同時(shí)相PTEN

3、蛋白的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞與正常肺上皮細(xì)胞PTEN mRNA水平；放線菌素D處理肺癌細(xì)胞與正常肺上皮細(xì)胞阻斷新生 RNA合成，RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)相 PTEN mRNA的水平。
　　2.根據(jù)生物信息學(xué)篩選可能降解PTEN mRNA的microRNA，northern blot檢測(cè)miRNA的表達(dá)。在肺腺癌細(xì)胞A549中轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑，RT-PCR法檢測(cè)PTEN mRNA表達(dá)的變化；Western印跡法檢測(cè)PTEN

4、蛋白的表達(dá)；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖狀態(tài)。
　　研究結(jié)果：
　　1. Western blot結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)與正常肺上皮細(xì)胞比較有不同程度的降低；使用放線菌酮處理A549和BEAS-2B后，24小時(shí)內(nèi)A549及BEAS-2B細(xì)胞PTEN蛋白表達(dá)無明顯改變。RT-PCR結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞中PTEN mRNA與正常人肺上皮細(xì)胞相比明顯降低；放線菌素D處理顯示肺癌細(xì)胞PTEN mRNA降解速率比正常肺上皮細(xì)胞降

5、解速率明顯加快。
　　2.人肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑后，轉(zhuǎn)染miR-103抑制劑組PTEN mRNA的表達(dá)量和蛋白水平較對(duì)照組出現(xiàn)明顯升高，細(xì)胞增殖能力受抑制；轉(zhuǎn)染miR-19a抑制劑組PTEN mRNA、PTEN蛋白的表達(dá)量均無明顯改變，細(xì)胞增殖能力無明顯改變；轉(zhuǎn)染miR-92b抑制劑組PTEN mRNA的表達(dá)量無明顯改變，PTEN蛋白的表達(dá)量略微升高，細(xì)胞增殖能力受抑制。
　　研究結(jié)論：
　　1.肺癌細(xì)胞中抑