大腸桿菌中吲哚丙酮酸的代謝工程研究.pdf

1、吲哚丙酮酸(IPA)是很多物質(zhì)的通用中間產(chǎn)物和構(gòu)造組件，這些物質(zhì)在醫(yī)藥和食品行業(yè)中有著重要價(jià)值。IPA同時(shí)也有著一系列廣泛的應(yīng)用，例如作為神經(jīng)系統(tǒng)的治療藥物，護(hù)膚品，以及發(fā)光體。化學(xué)合成IPA是一個(gè)復(fù)雜而且代價(jià)較高的過程。而利用L-氨基酸氧化酶的生物合成路徑中，其副產(chǎn)物過氧化氫會導(dǎo)致IPA的降解。TdiD作為特異性的色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，利用其進(jìn)行生物合成可能會成為高效率的IPA合成的替代方案。
　　大腸桿菌菌株W3110，在含有色氨酸的

2、培養(yǎng)基中，會有一定量的IPA基礎(chǔ)產(chǎn)量。本研究用W3110作為出發(fā)菌株，通過代謝工程的方法研究IPA的生物合成。為了提高IPA的產(chǎn)量，實(shí)施了以下的策略:第一步，通過在W3110菌株中引入密碼子優(yōu)化的tdiD基因，使IPA的水平從41.54±1.26 mg/L上升到52.54±2.08 mg/L;第二步，在確認(rèn)了增加苯丙酮酸含量的益處基礎(chǔ)上，構(gòu)建了重組菌株YL03，進(jìn)一步提高IPA的產(chǎn)量。YL03的構(gòu)建是以一個(gè)之前文獻(xiàn)中報(bào)告過的W3110缺

3、陷型菌株為基礎(chǔ)，重組表達(dá)含有不受反饋抑制的DAHP合成酶基因（aroFfbr）和分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶基因（pheAfbr）的質(zhì)粒。重組菌株YL03可以積累IPA的數(shù)量達(dá)到158.85±5.36 mg/L，這個(gè)產(chǎn)量是野生型W3110菌株的3.82倍;第三步，通過將Trc啟動子更換為一系列不同強(qiáng)度的組成型啟動子，并且增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)，來對tdiDco的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。在這些構(gòu)建的菌株當(dāng)中，YL08的IPA產(chǎn)量最高，可達(dá)到236.42±1

4、7.66 mg/L。這個(gè)IPA最高產(chǎn)量是野生型W3110產(chǎn)量的5倍以上。最后，本研究評估了敲除以及過表達(dá)色氨酸酶基因（tnaA）對IPA生物合成的影響。敲除tnaA會引起IPA水平的輕微下降，而過表達(dá)tnaA則會造成產(chǎn)量相當(dāng)嚴(yán)重地減少。
　　本論文還對Terrequinone A在大腸桿菌中的生物合成進(jìn)行了初步探討。TerrequinoneA合成通路包括tdiA-tdiE五個(gè)基因，通過tdiD得到IPA是其中的第一步。利用不同拷貝