CRP1在大鼠肝硬化組織及肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及意義.pdf

1、背景和目的:
　　 肝硬化是各種病因長(zhǎng)期作用而形成的彌漫性肝損害，是多種慢性肝病病情發(fā)展的終末階段，其主要發(fā)病機(jī)制是肝星狀細(xì)胞的增殖、活化。肝硬化起病隱匿，病情發(fā)展緩慢，晚期并發(fā)癥多，預(yù)后差、病死率高。肝硬化的發(fā)病機(jī)制及其防治是目前研究者們所關(guān)注的焦點(diǎn)。抑制肝星狀細(xì)胞的活化、誘導(dǎo)其凋亡是預(yù)防及早期治療肝硬化的關(guān)鍵。富含半胱氨酸蛋白1(CRP1)是富含半胱氨酸蛋白家族的一員，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，含有兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域，主要與肌動(dòng)蛋白相

2、互影響發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來(lái)研究報(bào)道CRP1在細(xì)胞的分化、凋亡、組織的纖維化等具有重要作用，因此備受關(guān)注。TGF-β1是目前已知最強(qiáng)的促肝星狀細(xì)胞活化的細(xì)胞因子，由于CRP1在肝星狀細(xì)胞的生物性調(diào)控和纖維形成中的作用還不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察CRP1在肝硬化組織及肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及其與TGF-β1的關(guān)系，來(lái)初步探討其在肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:
　　 1.建立模型
　　 1)肝硬化大鼠模型的建立清

3、潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重200g-230g，分兩組，正常組4只，模型組30只，以0.03％TAA作為初始濃度，然后根據(jù)每周體重變化調(diào)整飲用水中TAA濃度，制備肝硬化模型。模型組大鼠分別在造模后于8w、12w、14w、15w、16w隨機(jī)取6只大鼠處死，肉眼觀察肝臟表面狀況，切取肝臟組織，進(jìn)行HE染色及Masson三色染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察肝臟病理變化。
　　 2) HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的HSC-T6細(xì)胞，接種于含10％

4、胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h換液，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％-90％密度時(shí)，用0.25％胰蛋白酶液消化，按1∶3傳代。每次試驗(yàn)均在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞中進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞傳至第三代時(shí)，以1.8×105/ml接種于六孔板，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、TGF-β11ng/ml組、TGF-β5ng/ml組及TGF-β110ng/ml組，共4組。于48h后提取細(xì)胞的RNA。每組設(shè)三個(gè)復(fù)

5、孔。
　　 2.檢測(cè)指標(biāo)
　　 半定量RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織的α-SMA mRNA、TGF-β1mRNA及CRP1mRNA的表達(dá)量;熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞的α-SMAmRNA及CRP1mRNA的表達(dá)量。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、Dennett' s T3檢驗(yàn)和Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析，P＜0.05表

6、示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立TAA誘導(dǎo)的大鼠肝硬化模型:肝臟表面結(jié)節(jié)彌漫性增生，病理結(jié)果示肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，再生的肝細(xì)胞排列紊亂，聚集成團(tuán)，纖維條索大量增生，假小葉形成，大小不一，小葉內(nèi)中央靜脈可有或缺損。
　　 2.RT-PCR檢測(cè)α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA及CRP1mRNA結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，模型組α-SMAmRNA、TGF-β1mRNA及CRP1mRNA表達(dá)量都顯著

7、增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.成功復(fù)蘇了HSC-T6細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，通過(guò)TGF-β1干預(yù)肝星狀細(xì)胞的研究，再次驗(yàn)證了TGF-β1的強(qiáng)烈致纖維化作用。
　　 4.熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果:正常對(duì)照組，α-SMA mRNA及CRP1mRNA呈低水平表達(dá)，予TGF-β1干預(yù)后，α-SMAmRNA的表達(dá)量與正常組相比有明顯差異，且隨著TGF-β1的濃度增加而增加(P＜0.05)。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)，CRP1mRN

8、A的表達(dá)量與正常組相比亦有明顯差異，亦隨著TGF-β1的濃度增加而增加(P＜0.05)。相關(guān)性分析示CRP1mRNA與α-SMA mRNA的表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.993，P=0.007＜0.05)，表明CRP1mRNA的表達(dá)量變化與α-SMAmRNA的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.在肝硬化模型中，CRP1在病變肝組織的基因表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，表明CRP1與肝硬化的形成發(fā)展存在一定的相關(guān)性;<