白介素-10對(duì)TGFβ-,1-誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞表達(dá)CTGF及TIMP-1的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(HF)是慢性肝病共有的病理改變，肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展，可形成肝硬化，嚴(yán)重影響患者的健康與生命。肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化過(guò)程中起核心作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)是強(qiáng)有力的致纖維化的細(xì)胞因子，促進(jìn)HSC增殖活化，合成大量ECM，在纖維化進(jìn)程中起重要作用。白介素-10(IL-10)是一種炎癥抑制因子，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IL-10可減輕肝臟炎癥，抑制肝纖維化的發(fā)展，可望發(fā)展為抗肝纖維化藥物，但其作用機(jī)制尚未明確。

2、本研究通過(guò)用IL-10及TGFβ1單獨(dú)和共同干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞系γ-HSC99，采用半定量RT-PCR法檢測(cè)各組結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表達(dá)，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法觀察HSC表達(dá)α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)的變化，進(jìn)一步探討IL-10抗肝纖維化的作用機(jī)制。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、γ-HSC99細(xì)胞系為活化的大鼠肝臟星狀細(xì)胞。

3、 2、實(shí)驗(yàn)試劑 TGFβ1及重組大鼠IL-10；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；Taq酶；引物；DMEM培養(yǎng)基；α-SMA一抗；SP試劑盒；DAB顯色系統(tǒng)。 二、細(xì)胞培養(yǎng) 將γ-HSC99細(xì)胞復(fù)蘇后接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5％恒溫CO2培養(yǎng)箱中，每1-2天以0.25％胰蛋白酶消化傳代。 三、RT-PCR法檢測(cè) CTGF及TIMP-1 mRNA的表達(dá)用不同濃

4、度的IL-10(10、20、40ug/L)與TGFβ1(8ug/L)單獨(dú)和共同干預(yù)HSC 24、48、72h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，用分光光度法測(cè)定RNA含量及純度。用RNA PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，RT-PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳(100V，30 min)，用GDS凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳結(jié)果，各帶用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)掃描定量。 四、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)α-SMA的表達(dá) 用IL-10(

5、20ug/L)與TGFβ1(8ug/L)單獨(dú)和共同干預(yù)HSC 24h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)α-SMA的表達(dá)，在光鏡下觀察細(xì)胞爬片α-SMA的染色，應(yīng)用圖象分析儀器定性分析α-SMA的表達(dá)情況。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù) 以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組之間是否存在顯著性差異分析采用One-wayANOVA分析，LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05確定差異有無(wú)顯著意義。 結(jié)果： 1、半定量RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

6、 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳可見(jiàn)分別于383 bp(CTGF)和335 bp(TIMP-1)處的清晰擴(kuò)增條帶。灰度分析結(jié)果顯示：TGFβ1組與空白對(duì)照組(A組)比較，CTGF及TIMP-1mRNA表達(dá)均明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：IL-10各濃度組(C、D、E組)與空白對(duì)照組比較，基因表達(dá)差別無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；同時(shí)加入TGFβ1及不同濃度的IL-10(F、G、H組)與TGFβ1組(B組)比較，CTGF及TIMP-1m

7、RNA表達(dá)均明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著IL-10濃度的升高，抑制作用越明顯。 2、免疫組化結(jié)果 DAB顯色后，有棕褐色顆粒著色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，TGFβ1組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組明顯增多且染色顏色均偏深，故α-SMA的表達(dá)有所增加，IL-10單獨(dú)干預(yù)HSC細(xì)胞與空白對(duì)照組比較差異不大，而TGFβ1及IL-10共同作用HSC細(xì)胞與TGFβ1組細(xì)胞相比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少且染色顏色較淺，故α-SMA的表