氟西汀對(duì)抑郁癥模型小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用及其與自噬的相關(guān)性.pdf

1、本文通過(guò)建立慢性溫和應(yīng)激(Chronic mild stress，CMS)誘導(dǎo)的小鼠抑郁癥模型，研究氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬功能的調(diào)節(jié)及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞存活中的作用。研究發(fā)現(xiàn)氟西汀可以顯著改善CMS模型所致海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成;培養(yǎng)原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，離體研究發(fā)現(xiàn)氟西汀可以通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用;CMS模型小鼠海馬立體定位注射自噬抑制劑3-MA可取消氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，表現(xiàn)

2、為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞突起數(shù)量減少。上述結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬異常與抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性，氟西汀通過(guò)促進(jìn)自噬減少抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡。本文的研究揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬在氟西汀神經(jīng)保護(hù)和抗抑郁效應(yīng)中的作用，進(jìn)一步拓寬了對(duì)氟西汀治療抑郁癥分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為研發(fā)新型抗抑郁藥物提供了新的思路。
　　目的:
　　研究氟西汀對(duì)抑郁癥模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)，揭示其通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬發(fā)揮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)

3、胞的保護(hù)作用，闡明氟西汀抗抑郁作用的新機(jī)制。
　　方法:
　　1.本實(shí)驗(yàn)將雄性C57BL/6J小鼠（體重18-25g）隨機(jī)分為4組:對(duì)照組、氟西汀單獨(dú)給藥組、抑郁癥模型組和抑郁癥模型+氟西汀治療組，每組20只，每只單籠飼養(yǎng)，其中抑郁癥模型組、抑郁癥模型+氟西汀治療組給予慢性溫和應(yīng)激(CMS)，持續(xù)6周，此期間對(duì)照組、氟西汀單獨(dú)給藥組正常飼養(yǎng);通過(guò)糖水偏愛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型成功后，氟西汀單給藥組和抑郁癥模型+氟西汀治療組小鼠腹腔注射

4、氟西?。?0mg/kg/d，i.p.），同時(shí)對(duì)照組和抑郁癥模型組小鼠每天注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥4周后，通過(guò)糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)氟西汀對(duì)抑郁癥的治療作用;2.電鏡觀察小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的損傷及自噬小體的形成;3.培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，Westem blotting檢測(cè)自噬的經(jīng)典指標(biāo)LC3和p62的表達(dá)，GFAP-LC3熒光雙標(biāo)方法觀察氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié);4.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染mTag-Wasab

5、i-LC3質(zhì)粒，熒光顯微鏡下觀察氟西汀對(duì)皮質(zhì)酮模型下星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用;5.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，并使用MitoTracker deep red標(biāo)記線粒體，同時(shí)分別使用MitoTracker Green和LysoTracker標(biāo)記線粒體和溶酶體，觀察氟西汀對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬的作用;6.分別應(yīng)用H2DCF-DA和MitoSOX熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)和線粒體ROS，觀察給予氟西汀和皮質(zhì)酮刺激后細(xì)胞內(nèi)和線粒體R

6、OS的生成，同時(shí)應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)氟西汀和皮質(zhì)酮刺激后的細(xì)胞活力;7.CMS模型小鼠腹腔注射氟西汀和自噬抑制劑3-MA并在處死前一周側(cè)腦室注射3-MA(30μg)，小鼠腦組織經(jīng)多聚甲醛后固定、20％和30％蔗糖溶液梯度脫水后使用OCT膠包埋，Leica冰凍切片機(jī)制作25μm厚的海馬腦區(qū)連續(xù)切片，免疫熒光統(tǒng)計(jì)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和突起數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.氟西汀改善CMS模型小鼠抑郁樣行為小鼠造模5周后，糖水偏愛率

7、及強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間相較于生理鹽水組顯著下降，氟西汀腹腔注射4周后，相較于CMS模型組小鼠糖水偏愛率升高11％，強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間分別縮短38％和34％，表明氟西汀可顯著改善CMS模型小鼠的抑郁樣行為。
　　2.氟西汀改善CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成生理鹽水組小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，無(wú)損傷情況;單獨(dú)應(yīng)用氟西汀組小鼠線粒體形態(tài)正常，并可觀察到多個(gè)自噬小體;CMS模型組鏡下可觀察到大

8、量損傷的線粒體，且并未觀察到自噬小體的存在;氟西汀治療組鏡下線粒體形態(tài)正常，且可觀察到自噬小體對(duì)損傷線粒體的吞噬，表明氟西汀可顯著改善CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷并促進(jìn)自噬小體的形成。
　　3.氟西汀促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬氟西汀0.1、1.0、10μM三個(gè)濃度分別處理24h后，10μM氟西汀顯著上調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ比值(P＜0.01)，顯著下調(diào)自噬底物p62的表達(dá)(P＜0.01);氟西?。?0μM）處理12、24h后均顯著上

9、調(diào)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值，下調(diào)自噬底物p62的表達(dá)(P＜0.01)，其中24h時(shí)作用最顯著(P＜0.01)，相比于對(duì)照組LC3Ⅱ/Ⅰ比值上調(diào)了76％，p62的表達(dá)下調(diào)72％，表明10μM氟西汀處理24h顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬。
　　4.氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬小體和自噬溶酶體的形成使用GFAP和LC3抗體分別標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞和自噬小體，10μM氟西汀處理24h后，胞內(nèi)LC3Ⅱ表達(dá)量顯著多于對(duì)照組(P＜0.0

10、1);給予10μM皮質(zhì)酮刺激后，LC3Ⅱ表達(dá)量顯著減少(P＜0.05)，10μM氟西汀治療后顯著增加LC3Ⅱ表達(dá)量(P＜0.01)，相較于皮質(zhì)酮組，平均每個(gè)細(xì)胞中LC3Ⅱ表達(dá)量增加了10倍。使用mTag-Wasabi-LC3紅綠熒光質(zhì)粒標(biāo)記胞內(nèi)LC3蛋白，10μM氟西汀處理24h后，胞內(nèi)自噬小體（黃色斑點(diǎn)）數(shù)量和自噬溶酶體（紅色斑點(diǎn)）數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）;10μM皮質(zhì)酮刺激后胞內(nèi)自噬小體數(shù)量顯著下調(diào)(P＜0.01)，10μM氟

11、西汀治療后自噬小體顯著增加(P＜0.01)，自噬溶酶體數(shù)量亦顯著上調(diào)(P＜0.05)，相比于皮質(zhì)酮組，平均每個(gè)細(xì)胞中自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量分別增加了18倍和15倍。表明氟西汀可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬小體和自噬溶酶體的形成，保持自噬流的暢通。
　　5.氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬10μM皮質(zhì)酮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬，其中自噬小體和線粒體的共定位顯著減少(P＜0.05)，線粒體和溶酶體共定位顯著減少(P＜0.01)，胞漿P

12、arkin表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，線粒體Parkin表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，線粒體外膜蛋白TOMM20表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01);10μM氟西汀治療促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體自噬，其中自噬小體和線粒體共定位顯著增加（P＜0.05），線粒體和溶酶體共定位顯著增加（P＜0.01），相比于皮質(zhì)酮組分別增加了63％和49％，Parkin向線粒體的轉(zhuǎn)位顯著增加(P＜0.05)，相較于皮質(zhì)酮組增加了37％，10μM氟西汀處理后增

13、強(qiáng)了對(duì)線粒體外膜蛋白TOMM20的泛素化降解作用(P＜0.01)，與皮質(zhì)酮組相比，TOMM20蛋白表達(dá)減少了36％。表明氟西汀促進(jìn)皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞Parkin的線粒體轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)線粒體自噬，增加對(duì)線粒體蛋白TOMM20的降解。
　　6.氟西汀通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)揮對(duì)原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用應(yīng)用H2DCF-DA熒光探針標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)ROS，MitoSOX標(biāo)記線粒體ROS，10μM皮質(zhì)酮刺激24h后顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS和線粒體R

14、OS水平（P＜0.01），降低細(xì)胞活力(P＜0.01);氟西汀處理24h后胞內(nèi)和線粒體ROS生成減少（P＜0.05），細(xì)胞活力增強(qiáng)（P＜0.05），與皮質(zhì)酮組相比，線粒體ROS水平下降了25％，細(xì)胞活力上升了56％;給予自噬抑制劑3-MA(5mM)后，ROS釋放增多(P＜0.05)，細(xì)胞活力降低(P＜0.05)，相較于氟西汀治療組，線粒體ROS水平上升了22％，細(xì)胞活力下降30％。表明氟西汀通過(guò)促進(jìn)自噬減少皮質(zhì)酮模型星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體R

15、OS的釋放，增強(qiáng)細(xì)胞活力，發(fā)揮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　7.氟西汀通過(guò)促進(jìn)自噬發(fā)揮對(duì)CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用氟西汀逆轉(zhuǎn)CMS模型所致小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少以及行為學(xué)不動(dòng)時(shí)間的增加，與CMS組小鼠相比，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量增加了2倍，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加了38％。注射自噬抑制劑3-MA后，氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用被取消，相比于氟西汀治療組，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量顯著減

16、少(P＜0.01)，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)。表明氟西汀通過(guò)促進(jìn)自噬增加CMS模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量和SGZ區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)論:
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬異常與CMS所致小鼠抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性。
　　2.氟西汀通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬減少抑郁癥發(fā)生發(fā)展中星形膠質(zhì)細(xì)胞的死亡和萎縮，發(fā)揮對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
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