豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株HN07-1純化及PRRSV-IPMA篩選單克隆抗體.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩50頁(yè)未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原體,能引起母豬繁殖障礙及各年齡段豬嚴(yán)重的呼吸道癥狀。PRRSV是有囊膜的、單股正鏈RNA病毒,屬于尼多病毒目動(dòng)脈炎病毒科,直徑大約50~65nm,表面相對(duì)平滑,病毒粒子形

2、態(tài)多樣,以球形為主。PRRSV作為一種囊膜病毒,在宿主外的生存受溫度、pH、光照和培養(yǎng)基的影響。PRRSV熱穩(wěn)定性較差,其感染力隨溫度增加而降低;pH6.5~7.5時(shí)保持穩(wěn)定,在其他條件下病毒的感染能力下降,因此,PRRSV的純化工作難度較大,需要嚴(yán)格控制溫度、pH值等因素。目前一般采用超速離心沉淀法和蔗糖密度梯度離心法純化PRRSV,但這些方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí),難以大規(guī)模純化病毒,并且對(duì)儀器設(shè)備的要求較高。此外,對(duì)于有囊膜結(jié)構(gòu)的病毒來(lái)說(shuō)

3、,超速離心沉淀病毒和蔗糖的高黏稠和高滲透性會(huì)對(duì)病毒顆粒造成損傷,導(dǎo)致病毒感染能力下降及囊膜蛋白的丟失。
  為了克服以上缺點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)建立了一種溫和純化PRRSV方法,即采用差速離心、膜包超濾濃縮和Sepharose4Fast Flow(4FF)凝膠層析相結(jié)合的策略純化PRRSV。通過(guò)SDS-PAGE,Western-blot和檢測(cè)蛋白含量、病毒含量等方法分析純化效果,結(jié)果表明4FF純化后的病毒TCID50提高了50倍,病毒原液雜蛋

4、白的去除比率為99.68%,SDS-PAGE結(jié)果圖顯示未見(jiàn)明顯雜蛋白條帶;將純化好的病毒與等體積的弗氏佐劑乳化后免疫BALB/C雌性小鼠,通過(guò)免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)檢測(cè)其免疫效果,IPMA結(jié)果表明4FF純化病毒的免疫原性較好,特異性較強(qiáng),消除了免疫后小鼠血清與Marc-145細(xì)胞蛋白的非特異性反應(yīng)。
  按照常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備雜交瘤細(xì)胞株,融合前加強(qiáng)免疫一次,取其脾細(xì)胞,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合,分別

5、在CRL-2843-CD163細(xì)胞系和Marc145細(xì)胞系上采用IPMA試驗(yàn)篩選,共篩選到陽(yáng)性克隆孔15株,挑選其中的5株陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆化,獲得5株能穩(wěn)定分泌PRRSV抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1D1,9D4,6E7,7G8,7F12,其腹水IPMA效價(jià)均在1:106以上。用大腸桿菌表達(dá)的重組PRRSV N蛋白包被ELISA板,以抗PRRSV陽(yáng)性克隆細(xì)胞上清為一抗作間接ELISA,檢測(cè)抗PRRSV N蛋白單抗;用蛋白質(zhì)印跡(

6、Western-blotting)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,間接ELISA和Western-blotting結(jié)果表明1D1,9D4,7G8三株是針對(duì)PRRSV核衣殼N蛋白的特異性單抗,而6E7,7F12是針對(duì)PRRSV其它結(jié)構(gòu)蛋白表位。
  本實(shí)驗(yàn)的意義:一是建立了一種溫和純化PRRSV的方法,為規(guī)?;兓疨RRSV疫苗的工藝開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ);二是建立了在不同細(xì)胞系上采用免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)篩選出多株抗PRRSV單克隆抗體為研

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論