肝癌候選標志物NAP-2(73)在肝癌細胞和組織中的驗證實驗.pdf

1、肝癌是我國最常見、最具有危害性的惡性腫瘤之一。據(jù)WHO于2005年的統(tǒng)計，全世界每年新增肝癌患者62萬，約59萬人死于肝癌，在我國每年有20～30萬人死于肝癌，嚴重威脅我國人民的生命健康，因而一直是我國研究的重點腫瘤之一。而肝癌早期一般無明顯癥狀，一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已屆入中晚期。近幾十年來，肝癌總體預后并未得到顯著改善，難以明確診斷而失去手術的時機是重要的原因之一。因此尋找理想的生物標記物，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用的蛋白

2、質(zhì)分子，以用于肝癌的輔助診斷一直是肝癌研究領域的熱點和難點。 蛋白組學的出現(xiàn)為尋找新的腫瘤標志物帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)，也使尋找新的腫瘤標志物成為可能。本課題組的前期研究中，成功地運用SELDI-TOF-MS技術篩選肝癌患者血清中可能肝癌標記物，并在此基礎上對標志蛋白分離、純化，質(zhì)譜鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，相對為分子量7984Da的標志蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定為嗜中性活性肽2(NAP-2(73))，該蛋白可能為肝癌的候選血清標志物。 目的：

3、為了驗證SELDI篩選結(jié)果的可靠性，本研究通過制備NAP-2(73)多克隆抗體，研究嗜中性活性肽2(NAP-2(73))在肝癌細胞及組織中的表達水平。 方法：采用DNAstart軟件設計NAP-2(73)抗原表位，免疫新西蘭家兔制備NAP-2(73)多克隆抗體。采用Western bolt及Real-time定量RT-PCR技術對NAP-2(73)在肝癌細胞株7721和正常肝細胞株7702中的表達水平進行了檢測，并運用免疫細胞學

4、的方法檢測NAP-2(73)在肝癌細胞株7721和正常肝細胞株7702表達水平。在此基礎上，從廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科收集30例手術切除的肝癌及其癌旁組織，運用免疫組織化學的方法對NAP-2(73)在肝癌組織和癌旁組織中的表達進行了檢測。 結(jié)果：NAP-2(73)多克隆抗體效價為1:729000。Westem bolt和免疫細胞學的結(jié)果顯示，在肝癌細胞株中NAP-2(73)呈陽性表達，而在正常肝細胞株中無表達。Real-

5、time PCR結(jié)果顯示肝癌細胞株中NAP-2(73) mRNA表達比正常肝細胞株增加了7倍。NAP-2(73)在肝癌組織中表達率為100％，其中63.33％呈強陽性表達，癌旁組織無強陽性表達；經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩者NAP-2(73)的表達呈顯著差異。 結(jié)論：NAP-2(73)在肝癌細胞株的表達率為100％，而在人正常肝細胞株中無表達，且在肝癌組織和癌旁組織中的表達存在差異，驗證了初篩結(jié)果的可信性和生物信息學的分析和推測，提示NAP