整合素α-,5-β-,1-，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和蛋白激酶C在纖維粘連蛋白碎片誘導(dǎo)髓核細胞退變過程中的作用.pdf

1、間盤退變是一個復(fù)雜的過程，多種因素參與了間盤退變的過程。纖維粘連蛋白是一種存在于間盤細胞外基質(zhì)內(nèi)的糖蛋白，其可以被基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)分解為纖維粘連蛋白碎片(Fn—f)。研究表明，F(xiàn)n—f在退變間盤的含量明顯增加，且Fn—f有誘導(dǎo)間盤退變的作用。如果將Fn—f注入正常的間盤內(nèi)，間盤出現(xiàn)退變樣改變，而如果將Fn—f加入髓核細胞的培養(yǎng)液中，髓核細胞同樣發(fā)生退變。而且已證明纖維粘連蛋白和Fn—f在細胞膜上主要的受體是整合素α5β1。但是目

2、前對于Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的具體機制并不清楚。 整合素是一組細胞表面的黏附分子，是多種基質(zhì)蛋白的膜受體，其可以參與細胞的信號傳導(dǎo)，調(diào)控基因表達、細胞周期和細胞凋亡。研究表明整合素α1，α5，αv，β1，β3在正常人間盤組織內(nèi)表達，這些整合素亞基在間盤內(nèi)可以起到力學傳導(dǎo)器和基質(zhì)蛋白受體等作用。整合素有力學傳感器的作用，其可以在細胞把力學信號轉(zhuǎn)化為化學信號的過程中發(fā)揮作用。且整合素可以與間盤內(nèi)多種基質(zhì)蛋白相互作用，如α1β1亞單

3、位是膠原蛋白在間盤細胞膜上的主要受體，而α5β1亞單位是纖維結(jié)合蛋白的膜受體。然而目前并不清楚整合素在退變間盤內(nèi)的表達情況，而且同樣不清楚整合素α5β1在Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的過程中起到何種作用。 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)和蛋白激酶C(PKC)是兩種重要的信號傳導(dǎo)蛋白。已有研究表明ERK和PKC在間盤的退變過程中發(fā)揮作用，而且ERK和PKC在Fn—f誘導(dǎo)軟骨細胞退變的過程起到了信號傳導(dǎo)的作用。那么ERK和PK

4、C在Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的過程是否發(fā)揮同樣的作用？ 目的： 檢測整合素α1，α5，αv，β1，β3在退變的人間盤內(nèi)的表達情況。探討Fn—f加入髓核細胞培養(yǎng)液中后，整合素α5β1的表達情況和ERK1/2的活化情況。研究整合素α5β1，ERK1/2和PKC在Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的過程中起到的作用。 方法： 術(shù)中收集人間盤髓核標本40例，分為三組：正常組(n=10)，突出組(n=15)，脫出組(n=15

5、)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)和免疫沉淀技術(shù)比較整合素α1，α5，αv，β1，β3在以上三組內(nèi)的表達情況，同時比較了整合素的配體—膠原蛋白(Ⅰ和Ⅱ型)和纖維粘連蛋白的表達情況。 體外分離和培養(yǎng)兔間盤髓核細胞，在培養(yǎng)液中加入110 kDa纖維粘連蛋白碎片。通過免疫印跡技術(shù)、免疫熒光技術(shù)及RT-PCR的方法，檢測整合素α5β1亞基、Ⅱ型膠原蛋白、MMP9和MMP13的表達情況。通過免疫印跡技術(shù)檢測ERK1/2的磷酸化情

6、況。然后特異性抑制整合素α5β1的表達，觀察Fn—f對髓核細胞有何影響。利用ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑和PKC活化的特異性抑制劑來研究ERK1/2和PKC的作用。 結(jié)果： 1、整合素在人髓核組織中的表達情況 整合素α1，α5，αv，β1，β3在三組間盤都有表達。整合素α5在脫出組和突出組的表達分別是正常組的2.2倍和1.5倍。整合素β1在脫出組和突出組的含量分別是正常組的2.5倍和1.6倍。而纖維粘連蛋白在

7、退變髓核內(nèi)的表達同樣有升高的趨勢。但整合素α1，αv，β3在三組內(nèi)的表達沒有統(tǒng)計學差異。 2、Fn—f對于髓核細胞的影響 加入Fn—f后，髓核細胞的整合素α5和β1亞基表達明顯增加，而Ⅱ型膠原蛋白表達下降，MMP9和MMP13的表達增加，同時ERK1/2的磷酸化也明顯增強。 3、整合素α5β1在Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞過程中的作用 特異性抑制整合素α5β1表達后，F(xiàn)n—f不能誘導(dǎo)髓核細胞退變，Ⅱ型膠原蛋白、M

8、MP9和MMP13的表達沒有變化，ERK1/2的磷酸化也并沒有被增強。 4、ERK1/2和PKC的作用 ERK1/2磷酸化的特異性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X加入髓核細胞的培養(yǎng)基中后，F(xiàn)n—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的作用同樣被抑制。 討論： 已有研究表明隨著間盤由突出向脫出的發(fā)展，間盤退變的程度也越來越嚴重。即隨著間盤退變進程的發(fā)展，整合素α5和β1亞基在髓核內(nèi)的表達也隨之

9、增加。實驗中有意義的是纖維粘連蛋白和其受體α5和β1亞基有同樣的增加趨勢。并在進一步的實驗中證明了Fn—f可以增加其受體α5和β1亞基的表達。當然仍有很多其它因素可以影響整合素表達。缺氧環(huán)境就是整合素表達變化的重要原因之一，Risbud等發(fā)現(xiàn)在缺氧的環(huán)境下培養(yǎng)髓核細胞，可以增強細胞MAPK的活性，增加整合素亞基的表達。同樣壓力也可以影響整合素的表達，當間盤細胞在體外加壓培養(yǎng)后，某些整合素亞基的表達出現(xiàn)下降趨勢。當然以上這些實驗都是在體外

10、細胞培養(yǎng)的環(huán)境下進行的，由于體內(nèi)環(huán)境與體外細胞培養(yǎng)環(huán)境有很大區(qū)別，體內(nèi)多種因素共同作用于間盤造成其退變的結(jié)局，因此退變間盤內(nèi)整合素表達的變化可能是這些因素共同作用的結(jié)果。 Fn—f是間盤退變過程中纖維粘連蛋白的分解產(chǎn)物，其含量在退變間盤內(nèi)的含量明顯增加。究其原因有兩方面，一方面是纖維粘連蛋白在退變間盤內(nèi)的表達增多，另一方面在退變過程中MMP的表達明顯增加，而正是MMP將纖維粘連蛋白分解為Fn—f。而在體內(nèi)實驗和體外實驗都證明了

11、Fn—f有減少糖蛋白表達，促進基質(zhì)蛋白分解的作用。本實驗中同樣證明了這個結(jié)論，F(xiàn)n—f減少了Ⅱ型膠原蛋白的表達，增加了MMP9和MMP13的表達。研究Fn—f的退變機制時，Homandberg提出Fn—f的作用由Fn—f、MMP、纖維粘連蛋白、Ⅱ型膠原蛋白組成的正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f增加了MMP的表達，增加的MMP分解纖維粘連蛋白形成更多的Fn—f，而Ⅱ型膠原蛋白的表達減少是這個惡性循環(huán)的最終結(jié)局。而本實驗觀察到的Fn—f減少Ⅱ型膠

12、原蛋白的表達，增加MMP9和MMP13的表達正與這個理論一致。那么整合素α5β1在這個惡性循環(huán)中處于什么位置呢。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)Fn—f有促進整合素α5、β1亞基表達作用。由于整合素β5β1在Fn—f誘導(dǎo)間盤退變過程中起到了膜受體的作用，而Fn—f又有促進其受體表達增加的作用，那么Fn—f對于間盤作用的惡性循環(huán)可以做進一步的探討?？梢詫⒄纤卅?β1納入這個正反饋惡性循環(huán)，即Fn—f與髓核細胞膜上的整合素α5β1結(jié)合后，影響了髓核細胞

13、的代謝，MMP和受體整合素α5β1的表達都增加，MMP分解纖維粘連蛋白使Fn—f的量增加，而整合素α5β1表達的增加使Fn—f的結(jié)合位點增多，促進了Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的作用。因此，整合素α5β1既是Fn—f在間盤細胞上的受體，同時又是Fn—f誘導(dǎo)間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 ERK1/2和PKC同樣參與了Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的過程，ERK1/2的磷酸化在Fn—f的作用下明顯增強。而且ERK1/2磷酸化的特異

14、性抑制劑PD98059和PKC活化的特異性抑制劑GF109203X抑制了Fn—f誘導(dǎo)髓核細胞退變的作用。因此，可以認為ERK1/2和PKC同樣是Fn—f誘導(dǎo)間盤退變的正反饋惡性循環(huán)中的環(huán)節(jié)，即Fn—f與髓核細胞膜上的整合素α5β1結(jié)合后，激活細胞內(nèi)信號蛋白PKC，增強了ERK1/2的磷酸化，引起蛋白表達變化，增加了整合素α5β1和MMP的表達，減低了Ⅱ型膠原蛋白的表達，增加的MMP又進一步分解纖維粘連蛋白為Fn—f。 結(jié)論：