組蛋白甲基化酶Suv39h1調節(jié)成肌細胞分化的表觀遺傳機制研究.pdf

1、肌肉細胞分化是發(fā)育生物學的重要課題。肌肉細胞分化具有很復雜的分子機制，涉及到了多個肌肉相關基因、轉錄調控家族因子、信號通路的作用。肌肉調節(jié)因子家族MRFs(MRFs)和肌肉增強子2(MEF2)家族因子在肌肉分化過程中起著決定性的調控作用。而近來的研究發(fā)現(xiàn)表明組蛋白修飾酶也參與到肌肉細胞分化調控機制中并發(fā)揮了重要作用。然而目前的研究主要圍繞在組蛋白修飾酶與MyoD的相互作用，對于組蛋白修飾酶與MyoD下游的轉錄調節(jié)因子在肌細胞分化進程中是

2、何關系的研究很少。
　　本研究在研究豬組蛋白甲基化酶Suv39h1基因在豬體內的表達模式的基礎上;初步分析豬組蛋白甲基化酶Suv39h1在豬肌衛(wèi)星細胞中的生物學功能;并利用小鼠C2C12成肌細胞闡明組蛋白甲基化酶Suv39h1通過對MEF2的作用影響肌肉分化的機制。本研究對于深入了解肌肉細胞分化機制具有重要的理論價值。結果如下:
　　1.豬組蛋白甲基化酶Suv39h1基因及其輔助子異染色質蛋白HP1基因的克隆
　　通過

3、電子克隆技術、RT-PCR方法，從3月齡梅山豬背最長肌RNA模板中克隆分離出Suv39h1和HP1基因的全長編碼區(qū)。保守結構域預測顯示豬組蛋白甲基化酶Suv39h1及其輔助子異染色質蛋白HP1(HP1)具有典型的保守結構域結構:Suv39h1具有典型的Suv39h家族蛋白結構域:chromo domain和SET domain。HP1具有典型的異染色質蛋白家族的典型蛋白結構:chomo domain和chromo shadow doma

4、in。
　　2.組蛋白甲基化酶Suv39h1在梅山豬組織表達模式分析
　　分別通過半定量和定量PCR方法分子Suv39h1在梅山豬組織表達模式。表達模式結果表明:Suv39h1在生后90天梅山豬的心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、咬肌、直腸、半腱肌、肩脂、背脂、比目魚肌、背最長肌、股二頭肌組織中均有表達。Suv39h1在胚胎65天，出生后3天、35天、90天、150天及180天的最長肌、咬肌、半腱肌和股二頭肌中的表達沒有明顯變

5、化。
　　3.組蛋白甲基化酶Suv39h1在豬肌衛(wèi)星細胞中的調控作用分析
　　在豬肌衛(wèi)星細胞中超表達或干擾Suv39h1，培養(yǎng)細胞48h進行流式分析，檢測細胞周期。結果發(fā)現(xiàn)，超表達Suv39h1能夠抑制豬肌衛(wèi)星細胞在S期的DNA合成，使細胞滯留在G0/G1期。EdU標記超表達Suv39h1的肌衛(wèi)星細胞同樣表明超表達Suv39h1能夠減少豬肌衛(wèi)星細胞在S期的細胞數(shù)量。2％馬血清分化超表達或干擾Suv39h1處理的肌衛(wèi)星細胞8天

6、，免疫染色肌細胞分化晚期標志蛋白MyHC。免疫熒光結果表明，豬肌衛(wèi)星超表達或干擾Suv39h1，細胞顯示MyHC的數(shù)量明顯少于對照組。
　　4.組蛋白甲基化酶Suv39h1影響成肌細胞分化的機制
　　(1)組蛋白甲基化酶Suv39h1對成肌細胞增殖的影響
　　在C2C12細胞中超表達或干擾Suv39h1，培養(yǎng)細胞48h進行流式分析，檢測細胞周期。結果發(fā)現(xiàn)，超表達Suv39h1能夠抑制C2C12細胞在S期的DNA合成，使

7、細胞滯留在G0/G1期。而干擾Suv39h1能夠提高C2C12細胞在G2/M期的數(shù)量。EdU標記超表達Suv39h1的C2C12細胞同樣表明超表達Suv39h1能夠減少C2C12細胞在S期的細胞數(shù)量。
　　(2)組蛋白甲基化酶Suv39h1對成肌細胞分化的影響
　　2％馬血清分化超表達或干擾Suv39h1處理的C2C12細胞8天，免疫染色肌細胞分化晚期標志蛋白MyHC。免疫熒光結果表明，C2C12細胞超表達或干擾Suv39h

8、1，細胞顯示MyHC的數(shù)量明顯少于對照組。在C2C12細胞中超表達或干擾Suv39h1，生長培養(yǎng)以及2％馬血清分別分化培養(yǎng)2天、4天、6天，通過定量PCR方法分析C2C12細胞分化過程中的分化早晚期標志基因的表達模式。結果顯示，超表達Suv39h1的C2C12細胞和干擾Suv39h1的C2C12細胞中My f5的表達趨勢完全相反。超表達Suv39h1的C2C12細胞隨著分化時間的增加，My f5的表達呈現(xiàn)上調，而干擾Suv39h1的C2

9、C12細胞隨著分化時間的增加，My f5的表達呈現(xiàn)下調。在超表達或干擾Suv39h1的C2C12細胞細胞隨著分化時間的增加，Mef2c和MyHC的表達趨勢同對照組相比沒有明顯變化。
　　(3)組蛋白甲基化酶Suv39h1通過與MEF2C作用抑制MEF2C下游靶基因轉錄激活
　　2％馬血清分別分化處理C2C12細胞0天、2天、4天和6天，免疫染色Suv39h1，HP1和MEF2C在細胞中的定位情況。結果顯示:隨著C2C12細胞

10、分化天數(shù)的增加，Suv39h1，HP1和MEF2C在細胞中一直存在于細胞核內。哺乳動物雙雜交實驗結果表明:Suv39h1與MEF2C之間的相互作用存在于未分化的C2C12細胞，在分化的C2C12細胞中二者不存在相互作用。免疫共沉淀實驗結果證實Suv39h1與MEF2C在未分化的C2C12細胞中存在相互作用。MEF2報告系統(tǒng)分析結果表明:Suv39h1能夠抑制MEF2C下游靶基因的轉錄活性。
　　(4) HP1抑制Mef2c的轉錄激

11、活
　　超表達HP1顯著降低Mef2c啟動子活性和Mef2c在C2C12細胞的表達。綜上所述，本研究的結論是:
　　組蛋白甲基化酶Suv39h1參與豬肌衛(wèi)星細胞和C2C12細胞的細胞周期調控。超表達Suv39h1能夠抑制豬肌衛(wèi)星細胞和C2C12細胞分化。Suv39h1與MEF2C之間的相互作用存在于未分化的C2C12細胞，二者能夠在未分化的C2C12細胞中形成Suv39h1-MEF2C復合體，并且Suv39h1協(xié)同HP1能顯