組蛋白H2A去泛素化酶表觀調(diào)控間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能的研究.pdf

1、間充質(zhì)干細胞(MSCs)的免疫調(diào)控功能近年來受到廣泛的關(guān)注。MSCs可以抑制活化的淋巴細胞增殖，在許多炎性相關(guān)和自身免疫相關(guān)疾病中都被廣泛研究，但MSCs免疫調(diào)控的機制尚不完全清楚。
　　組蛋白的泛素化和去泛素化作用是表觀遺傳學(xué)研究的一個重要領(lǐng)域。MYSM1又稱為組蛋白H2A去泛素化酶，目前研究主要集中在與免疫相關(guān)的方面。已發(fā)現(xiàn)MYSM1缺陷小鼠可引起T細胞，B細胞，NK細胞，DC細胞等的發(fā)育異常。鑒于MYSM1在免疫系統(tǒng)中起著重

2、要的調(diào)控作用，而同樣具有免疫調(diào)節(jié)功能的MSCs是否也會受到MYSM1的調(diào)控，目前尚未見報道。研究MYSM1在MSCs免疫調(diào)控中的作用，對于MSCs的臨床應(yīng)用有著重要的意義，這也正是本文的研究目的和方向。本課題分為以下三部分。
　　第一部分:小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　方法:
　　1、通過基因型鑒定確認小鼠的基因表達，使用骨髓骨片分離法對野生型小鼠（下文簡稱為WT小鼠）和MYSM1敲除型小鼠（下文簡稱為K

3、O小鼠）的MSCs進行分離培養(yǎng)、敲除效率檢測、形態(tài)學(xué)觀察、免疫表型鑒定和多向分化能力鑒定。
　　2、利用慢病毒感染C3H/10T1/2細胞系，建立Mysm1干擾的MSCs并進行干擾效率的檢測，轉(zhuǎn)入空載體的細胞后文簡寫為shCTRL C3H，轉(zhuǎn)入MYSM1干擾序列的細胞后文簡寫為shMysm1 C3H。對慢病毒的感染效率進行檢測對細胞系來源的MSCs的進行形態(tài)學(xué)觀察、干擾效率檢測、免疫表型鑒定和多向分化能力鑒定。
　　結(jié)果:<

4、br>　　1、Mysm1敲除不影響MSCs的形態(tài)和表型。兩組MSCs均高表達Sca-1、CD105、CD29、CD44，不表達造血或內(nèi)皮相關(guān)的CD45、CD11b、CD31以及MHCⅡ類分子。
　　2、KO MSCs較WT MSCs有更快的增殖能力，細胞周期中有更多細胞處于S期，更少的細胞處于G0/G1期。
　　3、Mysm1敲除不影響MSCs的多向分化能力，兩組細胞均可誘導(dǎo)分化為成骨細胞和脂肪細胞;qRT-PCR結(jié)果顯示成

5、骨相關(guān)基因RUNX2和Osterix以及成脂相關(guān)基因PPARγ、CEBPα以及aP2在各自誘導(dǎo)條件下均高表達。
　　4、使用慢病毒成功干擾了C3H/10T1/2細胞中的Mysm1表達，干擾前后沒有對細胞的免疫表型和分化能力產(chǎn)生影響。
　　第二部分:MYSM1調(diào)控間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能的體內(nèi)與體外研究
　　方法:
　　1、通過qRT-PCR檢測MSCs在炎性刺激下Mysm1的表達水平變化。
　　2、利用MS

6、Cs與T細胞共培養(yǎng)來檢測WT MSCs和KO MSCs對T細胞增殖抑制的差異。
　　3、利用IBD模型檢測兩種不同的MSCs在體內(nèi)的免疫調(diào)控能力的差異。
　　4、檢測在炎性環(huán)境中，MSCs中免疫相關(guān)因子的mRNA水平的改變及細胞表面免疫相關(guān)分子的改變。
　　結(jié)果:
　　1、在IFNγ和TNFα的刺激下，小鼠MSCs中Mysm1表現(xiàn)為隨著炎性刺激的時間和刺激強度的增加而增加的特性，具有刺激時間和刺激強度依賴性。

7、r>　　2、體外MSCs與T細胞共培養(yǎng)實驗證實了KO MSCs具有比WT MSCs更強的抑制T細胞增殖的能力。體內(nèi)IBD模型證實了KO MSCs有比WT MSCs更強的減弱小鼠炎性損傷的能力。
　　3、在IFNγ和TNFα的刺激下，KO MSCs表現(xiàn)出比WT MSCs有更高的抗炎因子NO、iNOS、TGFβ、PGE2、A20的表達，更低的炎性因子IL-1β的表達，更高的表面和胞內(nèi)遷移相關(guān)因子CXCR4的表達量，更敏感的PD-L1的

8、活化刺激閾值，而遷移相關(guān)因子CCL2、CXCL9、CXCL10的表達無明顯差異，表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達無明顯差異。但KO MSCs較WT MSCs有更高的炎性因子TNFα和IL6表達水平。
　　8、shCTRL C3H和shMysm1 C3H表現(xiàn)出與骨片來源MSCs相似的炎性刺激后反應(yīng)。
　　第三部分:MYSM1調(diào)控間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)功能的機制
　　1、通過qRT-PCR和western blo

9、t檢測MSCs在炎性刺激下A20的表達水平。
　　2、檢測A20干擾與否MSCs的增殖和分化能力的改變。
　　3、利用MSCs與T細胞共培養(yǎng)來檢測A20干擾與否MSCs對T細胞增殖抑制能力的差異。
　　4、利用腫瘤模型檢測兩種不同的MSCs在體內(nèi)的免疫調(diào)控功能的差異。
　　5、通過qRT-PCR檢測炎性環(huán)境中MSCs免疫相關(guān)因子的改變和細胞表面免疫相關(guān)分子的變化。
　　6、通過western blot檢測在

10、炎性刺激下，MSCs中p38/MAPK信號通路的改變。
　　結(jié)果:
　　1、MSCs在炎性因子刺激下，A20的mRNA和蛋白水平均有明顯的時間和劑量依賴的特點。
　　2、A20干擾后，MSCs的形態(tài)和免疫表型未發(fā)生明顯改變，增殖能力略有增加，成脂分化能力明顯降低。
　　3、體外共培養(yǎng)顯示A20干擾后MSCs抑制T細胞增殖的能力減弱，體內(nèi)實驗顯示A20干擾后機體抗腫瘤的能力提升。
　　4、A20干擾后MSCs

11、中黏附分子ICAM-1和VCAM-1表達無明顯差異，NO表達無明顯差異，PD-L1表達無明顯差異。
　　5、A20干擾后，MSCs IL10的表達升高， TNFα的表達降低。
　　6、A20干擾后p38/MAPK通路的活化受到抑制。
　　結(jié)論:
　　MYSM1在MSCs的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，敲除Mysm1后MSCs的免疫抑制能力顯著增強。MYSM1可能通過抑制A20的表達來調(diào)控MSCs的免疫抑制能力