DNA羥甲基化酶Tet1促進(jìn)體細(xì)胞重編程機(jī)制的研究.pdf

1、在從受精卵到生物個(gè)體的發(fā)育過(guò)程中，表觀遺傳修飾指導(dǎo)著干細(xì)胞多能性的丟失和體細(xì)胞特性的獲得。通過(guò)在體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)特定轉(zhuǎn)錄因子，如Oct4(O)，Sox2(S)，Klf4(K)，c-Myc(M)，我們可以獲得具有多能性的干細(xì)胞(iPS cell)。這種已分化細(xì)胞重新獲得干細(xì)胞特性和分化潛能的過(guò)程被稱(chēng)為體細(xì)胞重編程。iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)的成功，是體細(xì)胞重編程領(lǐng)域的重大突破。然而很多問(wèn)題如誘導(dǎo)過(guò)程的分子機(jī)制等，尚未解決。這限制了iPS技術(shù)的進(jìn)一步

2、發(fā)展與臨床應(yīng)用。
　　從根本來(lái)說(shuō)，體細(xì)胞重編程的核心是表觀遺傳的重編程，它包括打破原有體細(xì)胞的表觀遺傳修飾穩(wěn)態(tài)，和建立ES細(xì)胞特異的表觀修飾穩(wěn)態(tài)。染色體上的表觀遺傳修飾主要包括:DNA的甲基化（脊椎動(dòng)物中主要發(fā)生在CpG序列），組蛋白修飾，核小體重構(gòu)和染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)等。重編程過(guò)程中的DNA去甲基化，被認(rèn)為是多能性相關(guān)的基因和調(diào)控區(qū)域活化的關(guān)鍵步驟之一。但去甲基化的機(jī)制并不清楚。
　　最新的研究發(fā)現(xiàn)Tet蛋白家族(Tet1，T

3、et2，Tet3)可以將甲基化胞嘧啶(5mC)氧化為羥甲基化胞嘧啶(5hmC)，之后通過(guò)不同途徑實(shí)現(xiàn)主動(dòng)或被動(dòng)去甲基化。然而對(duì)于iPS誘導(dǎo)過(guò)程，Tet蛋白是否參與多能性基因的去甲基化和重新活化并不清楚。我們正是通過(guò)對(duì)Tet1在iPS誘導(dǎo)重編程的功能研究，探索DNA修飾改變和表觀遺傳重編程的機(jī)制。我們利用已有的OSKM第二輪誘導(dǎo)重編程系統(tǒng)，證明Tet1能夠促進(jìn)體細(xì)胞重編程，通過(guò)多種分子和生化手段，我們證明5hmC和Tet1參與了OSKM誘

4、導(dǎo)過(guò)程中核心多能基因Oct4的去甲基化和表達(dá)激活:Tet1可以結(jié)合于Oct4的調(diào)控區(qū)域，過(guò)表達(dá)Tet1可以促進(jìn)Oct4轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域5hmC的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)該區(qū)域的去甲基化和活性組蛋白修飾的獲得，提前實(shí)現(xiàn)Oct4的轉(zhuǎn)錄激活。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Tet1能夠取代傳統(tǒng)iPS誘導(dǎo)中最重要的轉(zhuǎn)錄因子Oct4，并在其他轉(zhuǎn)錄因子輔助下實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程(TSKM，TSK)。我們建立了TSKM的二次誘導(dǎo)體系，并發(fā)現(xiàn)Tet1對(duì)內(nèi)源Oct4的調(diào)節(jié)機(jī)制同樣通過(guò)

5、DNA的羥甲基化。因此，Tet1對(duì)于Oct4的激活不依賴(lài)于外源Oct4的表達(dá)。在TSKM二次誘導(dǎo)體系中，體細(xì)胞重編程能夠在一周內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并可以在誘導(dǎo)的早期（72小時(shí)）觀察到廣泛的轉(zhuǎn)錄水平變化和明顯的5hmC和5mC改變。通過(guò)高通量測(cè)序等綜合分析，我們發(fā)現(xiàn)在這一重編程中，5hmC參與了多個(gè)重要的多能性基因和多能性調(diào)控區(qū)域的去甲基化，5mC與5hmC共同參與了基因組水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這表明在Tet1介導(dǎo)的重編程體系中，DNA甲基化和羥甲基化可能