TNF-α，G-CSF及VEGF對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面黏附分子L-選擇素和血管細(xì)胞黏附分子-1表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，MSCs)經(jīng)不同濃度的腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor alpha，TNF-a)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony-stimulating factor，G-CSF)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)預(yù)處理后不同時(shí)間段

2、，其表面黏附分子L-選擇素(L-selectin，CD62L)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1，CD106)的表達(dá)的變化，以及其表達(dá)變化與細(xì)胞因子濃度之間的關(guān)系，從而為經(jīng)細(xì)胞因子預(yù)處理的MSCs用于移植治療心力衰竭提供一個(gè)最佳的細(xì)胞因子濃度，為提高移植成功率打下基礎(chǔ)。 方法： 1．大鼠MSCs的培養(yǎng)：采用密度梯度離心法收集大鼠MSCs并用貼壁培養(yǎng)法對(duì)

3、其進(jìn)行擴(kuò)增和純化。 2．大鼠MSCs的鑒定：采用免疫組化的方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 3．細(xì)胞因子預(yù)處理：于不同孔板細(xì)胞中加入不同濃度TNF-a(濃度分別為100pg/ml、1ng/ml和10ng/ml)、G-CSF(濃度分別為1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)和VEGF(濃度分別為 1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)分別作用12小時(shí)和24小時(shí)。 4．大鼠MSCs的消化分離以及標(biāo)記：將貼壁生長(zhǎng)

4、的大鼠MSCs經(jīng)消化后加入PBS溶液進(jìn)行洗滌離心，收集細(xì)胞，使之成為單細(xì)胞懸液，后加入熒光標(biāo)記的流式抗體，于暗箱孵育三十分鐘。 5．?dāng)?shù)據(jù)記錄：采用流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)對(duì)大鼠MSCs表面的黏附分子CD62L和CD106的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1．培養(yǎng)的大鼠MSCs呈成纖維細(xì)胞樣表型，貼壁生長(zhǎng)，經(jīng)擴(kuò)增傳代后細(xì)胞呈紡錘樣，分布均勻，其余血細(xì)胞幾乎消失，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定CD44和CD9

5、0呈陽性，CD45和CD34呈陰性，為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2．經(jīng)TNF-a預(yù)處理12小時(shí)的大鼠MSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面CD62L和CD106均成陽性表達(dá)的細(xì)胞占所檢測(cè)細(xì)胞的百分比與未加入任何細(xì)胞因子預(yù)處理的空白組大鼠MSCs相比較，當(dāng)TNF-a濃度分別為100pg/ml時(shí)，1ng/ml時(shí)，10ng/ml時(shí)，與空白組比較P=0.029(P<0.05)，不同濃度組間比較P=0.007(P<0.01)；而作用24小時(shí)后其CD

6、62L，CD106的雙陽性表達(dá)率在濃度分別為100pg/ml，1ng/ml， 10ng/ml時(shí)，與空白組比較P=0.029(P<0.05)，不同濃度組間比較P=0.007(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3．用G-CSF預(yù)處理12小時(shí)的大鼠MSCs其表面CD62L和CD106雙陽性表達(dá)百分比在其濃度分別為1ng/ml，10ng/ml和100ng/ml時(shí)表面CD62L和CD106雙陽性表達(dá)百分比與空白組相比P=0.029(P

7、<0.05)；處理24小時(shí)后其表面CD62L，CD106雙陽性表達(dá)率與空白組相比P=0.029(P<0.05)；不同濃度組間比較P=0.007(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4．用VEGF預(yù)處理12小時(shí)的大鼠MSCs表面CD62L和CD106雙陽性表達(dá)百分比在濃度為1ng/ml時(shí)，與空白組比較P=(P>0.05)，10ng/ml時(shí)表面CD62L和CD106雙陽性表達(dá)百分比與空白組比較P=0.886(P>0.05)，在濃度

8、為100ng/ml時(shí)表面CD62L和CD106雙陽性表達(dá)百分比與空白組比較P=1(P>0.05)；處理24小時(shí)后，各濃度組表面CD62L，CD106的雙陽性表達(dá)率與空白組相比較，其P值分別為0.486(P>0.05)，1(P>0.05)和0.886(P>0.05)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度組間P=0.926(P>0.05)，也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 5．12小時(shí)和24小時(shí)兩個(gè)預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)之間相比較．P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。