粘附分子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)和局部遷移中的作用.pdf

1、研究背景：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中一種非造血類干細(xì)胞。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有多向分化潛能、低免疫原性和易于體外擴(kuò)增等特點(diǎn)，因此受到醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前，運(yùn)用MSCs移植進(jìn)行細(xì)胞替代治療，已被廣泛引用于研究治療各種缺血或損傷性疾病以及器官移植抗免疫排斥反應(yīng)等，并取得了初步效果，干細(xì)胞替代治療有望成為臨床上一種新的治療手段。然而，臨床應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，MSCs移植后，

2、能在局部停留、分化的細(xì)胞較少，難以滿足組織修復(fù)的需要。因此，尋求促進(jìn)較多的MSCs向受損組織遷移、定居進(jìn)而分化成特定的組織細(xì)胞，成為目前細(xì)胞替代治療中亟待解決的問題。 目前，運(yùn)用骨髓MSCs移植替代治療主要有兩種方式：經(jīng)局部血管輸入MSCs法和損傷組織局部注射法。其中，經(jīng)局部血管輸入法是最常用的方法。經(jīng)局部血管輸入的MSCs首先需要穿過毛細(xì)血管內(nèi)皮，向目的器官或組織定向遷移或“歸巢”，才能在局部微環(huán)境的作用下進(jìn)行分化，發(fā)揮修復(fù)治

3、療作用。 研究發(fā)現(xiàn)，MSCs有向缺血或損傷組織歸巢的特征，推測(cè)在這一過程中，粘附分子和趨化因子可能起關(guān)鍵作用。目前對(duì)于骨髓MSCs“歸巢”分子機(jī)制的研究尚少。因此，本文擬通過研究大鼠MSCs粘附分子表達(dá)及其與血管內(nèi)皮的粘附機(jī)制，探尋促進(jìn)MSCs向損傷組織“歸巢”的有效方法，希望對(duì)臨床應(yīng)用提供有力證據(jù)。 目的：研究炎性因子對(duì)骨髓MSCs粘附分子表達(dá)及其干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的影響，探討運(yùn)用較少劑量的炎性因子刺激MSCs粘附分子

4、的有效表達(dá)、促進(jìn)移植的MSCs向局部組織遷移的可行性。 方法：采用全骨髓直接貼壁法獲取大鼠原代MSCs，體外培養(yǎng)至第三代用于以下實(shí)驗(yàn)：(1)將培養(yǎng)的骨髓MSCs分別用不同濃度(2～20ng/ml)的腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)刺激24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)率：血管細(xì)胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1

5、)，細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，L-選擇素(L-selectin)，遲反應(yīng)性抗原(Very late activation antigen，VLA-4)的表達(dá)率；(2)分離培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別用上述幾種濃度的TNF-α預(yù)刺激的MSCs與大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)12h，計(jì)數(shù)粘附的MSCs，與細(xì)胞流式結(jié)果相結(jié)合，分析得出最佳TNF-α因子的刺激濃度；(3)

6、流式細(xì)胞術(shù)鑒定TNF-α刺激后MSCs特異性抗原的變化；(4)制作大鼠后肢缺血損傷模型，24h后經(jīng)頸靜脈輸注經(jīng)四甲基吲哚羧花青高氯酸鹽(1，1-Dioctadecyl-3，3，3，3-tetramethylindocarbocyanine Iodade)標(biāo)記、10ng/ml的TNF-α預(yù)刺激的MSCs。輸注MSCs 24h后取后肢肌肉組織，做冰凍切片，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)組織中的MSCs數(shù)目。以上實(shí)驗(yàn)均設(shè)不加TNF-α刺激組作空白對(duì)照。

7、 結(jié)果：(1)生理狀態(tài)下，大鼠骨髓MSCs表面粘附分子ICAM-1表達(dá)較高，而其它粘附分子VCAM-1、L-selectin、VLA-4表達(dá)較低；TNF-α刺激后，粘附分子VCAM-1表達(dá)升高，且表達(dá)率呈濃度依賴性；ICAM-1、L-selectin、VLA-4的表達(dá)在TNF-α刺激前后無明顯變化；(2)10ng/ml、20ng/ml TNF-α預(yù)刺激的MSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附能力明顯增強(qiáng)；(3)用10ng/ml的TNF-α預(yù)刺激

8、MSCs，其表面干細(xì)胞標(biāo)志物沒有明顯改變；(4)將10ng/ml TNF-α預(yù)刺激的MSCs移植到大鼠體內(nèi)，損傷肌肉組織內(nèi)的MSCs數(shù)目明顯多于對(duì)照組。 結(jié)論：(1)炎性因子TNF-α能夠明顯增強(qiáng)大鼠MSCs表面粘附分子VCAM-1的表達(dá)，但對(duì)大鼠MSCs表面粘附分子ICAM-1、L-selectin和VLA-4的表達(dá)沒有影響。 (2)10ng/ml的TNF-α能有效促進(jìn)MSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，提高M(jìn)SCs向受損部