人原代晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF基因下調(diào)對波形蛋白和αB-晶狀體蛋白含量的影響.pdf

1、研究目的：
　　 研究人原代晶狀體上皮細(xì)胞中PEDF基因表達與波形蛋白和αB-晶狀體蛋白的關(guān)系。
　　 材料和方法：
　　 眼組織來源：人尸體眼球來源于中山眼科中心眼庫。所有與尸體解剖相關(guān)性的研究均已通過中山大學(xué)人文倫理委員會的許可。我們所有的研究均遵照政府及相關(guān)公共組織的關(guān)于人類及動物實驗倫理道德條款。
　　 人晶狀體原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：晶狀體上皮細(xì)胞貼敷于尸體眼的晶狀體前囊膜下。在解剖顯微鏡下，撕取晶

2、狀體的前囊膜，平鋪于培養(yǎng)皿底部，上皮細(xì)胞面向上。滴取一滴胎牛血清與上皮細(xì)胞面，保持細(xì)胞面的濕潤。放于37℃0.5％CO2的培養(yǎng)箱孵育2小時，使前囊膜充分貼敷于培養(yǎng)皿的底部。用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
　　 采用GenScript's siRNA design center siRNA Target Finder和siRNA ConstructBuilder軟件設(shè)計三個shRNA序列，用于人PEDF基因

3、的RNA干擾。運用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將這些寡核苷酸序列克隆到質(zhì)粒載體SD1211上。然后通過Gateway技術(shù)將設(shè)計的寡核苷酸序列克隆到pLenti6/V5-D-TOPO質(zhì)粒載體中，用于慢病毒的產(chǎn)生。在用慢病毒感染細(xì)胞48小時后，用RNeasy plus Mini kit提取細(xì)胞中的總RNA。做三次重復(fù)的實時定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)。實驗中我們采用家族管理基因GAPDH作為對照基因。用△△Ct得出不同組PEDF

4、基因RNA水平含量的差別。人原代晶狀體上皮細(xì)胞PEDF基因RNA干擾48小時后，Western Blot方法檢測其中波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白表達水平的變化。
　　 結(jié)果：
　　 人晶狀體原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng)：
　　 帶有晶狀體上皮細(xì)胞的人晶狀體前囊膜完整的貼敷于培養(yǎng)皿上，24小時觀察到健康的晶狀體上皮細(xì)胞貼敷于前囊膜上，5天后晶狀體上皮細(xì)胞溢出囊膜范圍，遷移到培養(yǎng)皿上。10天后，培養(yǎng)皿上上皮細(xì)胞達到70％-8

5、0％的融合，并且呈現(xiàn)出正常的上皮源性細(xì)胞的形態(tài)特征。
　　 慢病毒感染人原代晶狀體上皮細(xì)胞：鑒于普通質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在原代上皮細(xì)胞上的成功率比較低，所以我們構(gòu)建了慢病毒載體結(jié)構(gòu)來表達shRNA，以達到對PEDF基因下調(diào)的目的。同時我們在構(gòu)建的shRNA結(jié)構(gòu)中表達綠色熒光(GFP)片斷，以便于觀察感染的效率。在熒光顯微鏡下，對感染48小時后的細(xì)胞照相，我們發(fā)現(xiàn)每一組的感染率都在80％左右。
　　 shRNA作用下PEDF基因被

6、下調(diào)的效果鑒定
　　 表達相應(yīng)shRNA的慢病毒感染人晶狀體原代上皮細(xì)胞48小時后，收集細(xì)胞，提取RNA。用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測PEDF基因mRNA水平的表達變化。最終發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)任何慢病毒感染的對照組，以及表達非特異性隨機序列shRNA(scramble group)的慢病毒組PEDF的mRNA在大致相同的表達水平。其余的三種針對于PEDF基因進行特異性RNA干擾的慢病毒組，其PEDF的RNA水平

7、與對照組以及scramble組比較均有顯著的下調(diào)(p＜0.01)。PEDF基因被干擾后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化
　　 用Western Blot的方法檢測對PEDF基因進行RNA干擾48小時后波形蛋白以及αB-晶狀體球蛋白含量的變化。用GAPDH作為內(nèi)參基因。與未經(jīng)感染的對照組比較，αB-晶狀體球蛋白的表達量在shRNA-scramble組中增加～30％，在shRNA-1試驗組明顯增加～219％，在shRNA-2

8、試驗組增加～204％，在shRNA-3試驗組增加～93％.波形蛋白的表達量在shRNA-scramble試驗組組中降低約～13％在shRNA-1試驗組中明顯降低約～72％，shRNA-2試驗組中降低～79％，在shRNA-3試驗組中降低～93％.這項試驗結(jié)果顯示在特異性針對PEDF基因進行RNA干擾的試驗組(shRNA2，shRNA3和shRNA4)，波形蛋白的表達量明顯降低，而αB-晶狀體球蛋白的表達量卻顯著升高(P＜0.05).(O