脂肪來(lái)源干細(xì)胞對(duì)肥胖相關(guān)炎癥及胰島素抵抗的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的:
　　擬通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究ADSC對(duì)于肥胖相關(guān)炎癥及胰島素抵抗的作用。我們通過(guò)建立肥胖模型，并對(duì)模型小鼠進(jìn)行ADSC干預(yù)治療，證實(shí)了ADSC能夠緩解肥胖誘發(fā)的慢性炎癥以及胰島素抵抗;并且通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了ADSC通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抑炎M2型轉(zhuǎn)化而抑制脂肪組織炎癥。這為ADSC作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在臨床上治療肥胖和相關(guān)代謝疾病提供了新的思路。
　　方法:
　　1.飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的建立
　　8周齡C

2、57BL/6雄性小鼠分別給予高脂飲食喂養(yǎng)或常規(guī)對(duì)照飲食喂養(yǎng)。造模喂養(yǎng)共進(jìn)行15周，期間每周進(jìn)行小鼠體重的監(jiān)測(cè)，繪制成曲線。
　　2.脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)的分離、擴(kuò)增及鑒定
　　剝離C57BL/6雄性小鼠附睪處脂肪組織，剪碎后加入含有Ⅰ型膠原酶的KRB緩沖液消化。離心得到細(xì)胞沉淀，即為含有ADSC的脂肪組織基質(zhì)細(xì)胞(SVF)，可經(jīng)傳代培養(yǎng)進(jìn)行純化。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80％時(shí)（約6天左右），可進(jìn)行傳代。檢測(cè)第三代ADS

3、C表面CD105、CD90、CD44以及CD11b、CD34、MHC-Ⅱ分子的表達(dá)情況。
　　3.ADSC體內(nèi)示蹤及體內(nèi)干預(yù)
　　3.1.ADSC的體內(nèi)示蹤
　　第三代的ADSC在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，在培養(yǎng)基中加入EdU培養(yǎng)24h。通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Apollo(R)567及Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記效率。將標(biāo)記效率高于90％的ADSC配制成1×106/ml的細(xì)胞懸液，注射于高脂喂養(yǎng)8周后的C57BL/6雄性小鼠。分別于注射

4、后3天和7天后處死小鼠，取附睪處脂肪組織進(jìn)行EdU染色。熒光顯微鏡下觀察ADSC定位的情況。
　　3.2.ADSC的體內(nèi)干預(yù)
　　小鼠高脂8周之后，開(kāi)始進(jìn)行ADSC干預(yù)治療。以7天為一個(gè)周期，分別進(jìn)行生理鹽水和ADSC細(xì)胞懸液的注射。整個(gè)干預(yù)時(shí)長(zhǎng)6周。
　　4.ADSC治療對(duì)小鼠相關(guān)代謝參數(shù)的影響
　　ADSC治療過(guò)程中或治療后，分別對(duì)小鼠進(jìn)行餐后血糖檢測(cè)、GTT和ITT實(shí)驗(yàn)以及血清甘油三酯和總膽固醇檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證A

5、DSC治療對(duì)于小鼠代謝參數(shù)的影響。
　　5.ADSC治療對(duì)于高脂小鼠白色脂肪組織的影響
　　ADSC干預(yù)6次后處死小鼠，分別取各組小鼠附睪周圍的白色脂肪組織。對(duì)脂肪組織進(jìn)行稱重，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖統(tǒng)計(jì)。對(duì)脂肪組織進(jìn)行切片、HE染色，通過(guò)像素反映細(xì)胞大小并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。提取脂肪組織的RNA，通過(guò)Real-time PCR的方法檢測(cè)脂肪組織相關(guān)的基因表達(dá)。
　　6.ADSC治療對(duì)脂肪組織炎癥的影響
　　6.1.免疫熒光檢測(cè)

6、巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)
　　取各組脂肪組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD68的表達(dá)情況并進(jìn)行拍照。
　　6.2.脂肪組織塊體外培養(yǎng)檢測(cè)炎癥因子釋放
　　將小鼠脂肪組織碎塊進(jìn)行培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清用于檢測(cè)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。采用CBA方法檢測(cè)脂肪組織培養(yǎng)上清中的相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、IL-10、MCP-1、TNF-α、IL-12的表達(dá)。使用BD FACS Calibur Flow Cyt

7、ometer流式細(xì)胞儀中CBA試劑盒專用程序進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果由FCAP Array v1.0(BD biosciences)分析，數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　7.ADSC治療對(duì)于脂肪組織局部巨噬細(xì)胞表型的影響
　　分離提取出小鼠附睪處脂肪組織中的SVF，通過(guò)Real-time PCR的方式檢測(cè)小鼠SVF中iNOS、Arginase-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12等的mRNA水平的表達(dá)情況。流式細(xì)

8、胞術(shù)的方式檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的變化。以CD11b作為巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，用PE-CD11b熒光抗體標(biāo)記SVF中的巨噬細(xì)胞，再以MHC-Ⅱ類分子、IL-10分別作為M1型和M2型的標(biāo)志，通過(guò)陽(yáng)性百分率與平均熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)ADSC治療對(duì)于巨噬細(xì)胞表型的影響。
　　8.體外實(shí)驗(yàn)研究ADSC對(duì)于巨噬細(xì)胞表型的影響
　　利用ADSC培養(yǎng)上清與腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的方式評(píng)估ADSC體外對(duì)于巨噬細(xì)胞表型變化的影響。用Real-time P

9、CR檢測(cè)ADSC對(duì)于M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α在mRNA水平的影響。Western blot的方法檢測(cè)iNOS，Arginase-1，以及信號(hào)通路中p-p65、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)的方式檢測(cè)ADSC上清對(duì)于M1巨噬細(xì)胞MHC-Ⅱ類分子與IL-10的表達(dá)影響。
　　結(jié)果:
　　1.高脂飲食可減少小鼠附睪處脂肪組織內(nèi)ADSC的含量
　　流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果

10、表明，高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠脂肪組織內(nèi)ADSC的數(shù)量比例較常規(guī)飲食小鼠有明顯減少，可能是引發(fā)脂肪細(xì)胞功能紊亂和脂肪組織慢性炎癥的原因之一。
　　2.體外擴(kuò)增的ADSC體內(nèi)轉(zhuǎn)輸時(shí)可成功定位于肥胖小鼠的白色脂肪組織
　　腹腔注射ADSC3天后即可在脂肪組織處觀察到紅色熒光標(biāo)記的ADSC，而7天時(shí)紅色熒光的表達(dá)量和密度更高，提示體外擴(kuò)增的ADSC通過(guò)腹腔注射的方法可以成功定位于腹內(nèi)白色脂肪組織中。
　　3.ADSC體內(nèi)干預(yù)可以改

11、善高脂小鼠的代謝失調(diào)
　　將高脂小鼠分為注射ADSC組(HFD-ADSC)和注射生理鹽水組(HFD-NS)，以正常飲食小鼠注射生理鹽水組(ND-NS)作為對(duì)照。較HFD-NS組而言，HFD-ADSC組治療后餐后血糖有下降趨勢(shì)。GTT和ITT結(jié)果表明，相對(duì)于HFD-NS組，HFD-ADSC組小鼠胰島素敏感性和葡萄糖耐性都有明顯的好轉(zhuǎn)，且在多時(shí)間點(diǎn)上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血清膽固醇和甘油三酯的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HFD-NS組較ND-NS組血清甘油

12、三酯濃度明顯上調(diào)，而ADSC治療之后則呈現(xiàn)出顯著下調(diào)，而膽固醇變化則不大。
　　4.ADSC體內(nèi)干預(yù)可以減輕肥胖誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞肥大
　　對(duì)小鼠及其脂肪組織進(jìn)行稱重發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)可以導(dǎo)致小鼠體重及白色脂肪組織重量的明顯增加，而ADSC治療對(duì)于小鼠體重以及白色脂肪組織的重量均無(wú)明顯影響。而通過(guò)細(xì)胞大小統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)ADSC治療確實(shí)明顯減小了脂肪細(xì)胞的大小，并且Leptin的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。同時(shí)檢測(cè)到PPAR-γ的表達(dá)在mRN

13、A水平上呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而Adiponectin的表達(dá)并沒(méi)有檢測(cè)出明顯的差別。
　　5.ADSC治療可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的白色脂肪組織炎癥
　　小鼠外周血中炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果顯示ADSC治療后小鼠血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ、 IL-12以及MCP-1的表達(dá)均有下調(diào)的趨勢(shì)。而脂肪組織塊體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，ADSC治療后的小鼠脂肪組織局部釋放出的促炎分子TNF-a明顯較HFD-NS組低，而抑炎分子IL

14、-10的表達(dá)則明顯升高。CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞的免疫熒光結(jié)果顯示，ADSC治療后可明顯減少巨噬細(xì)胞形成的皇冠樣結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果表明，ADSC體內(nèi)干預(yù)后可以減輕白色脂肪組織炎癥。
　　6.ADSC體內(nèi)干預(yù)可誘導(dǎo)高脂小鼠白色脂肪組織中的巨噬細(xì)胞發(fā)生表型重塑
　　對(duì)各組小鼠脂肪組織處SVF mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，HFD-NS組較ND-NS組小鼠，其TNF-α、IL-12的表達(dá)明顯上調(diào)，而HFD-ADSC組小鼠則呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，

15、并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與之相應(yīng)，抑炎因子IL-10的表達(dá)也因ADSC治療呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，iNOS與Arginase-1的比值在ADSC治療后顯示出降低的趨勢(shì)。流式分析結(jié)果顯示，ADSC治療組CD11b+巨噬細(xì)胞中MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)顯著下調(diào);同時(shí)，IL-10在胞內(nèi)的表達(dá)則顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，ADSC體內(nèi)干預(yù)后可以誘導(dǎo)高脂小鼠白色脂肪組織中的巨噬細(xì)胞發(fā)生表型重塑。
　　7.ADSC可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞在體外的表型轉(zhuǎn)換
　　Rea

16、l-time PCR的結(jié)果顯示，經(jīng)LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)，M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-6、TNF-α、IL-12等炎性因子，而加入ADSC培養(yǎng)上清后，TNF-α、IL-12的表達(dá)都受到了抑制，而IL-10的表達(dá)則呈現(xiàn)明顯的上調(diào)。蛋白水平的檢測(cè)結(jié)果顯示LPS聯(lián)合IFN-γ刺激后，巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)明顯上調(diào)，表現(xiàn)為典型的M1型，而加入ADSC培養(yǎng)上清后，iNOS的上調(diào)明顯受到了抑制。同樣，流式分析結(jié)果顯示，LPS聯(lián)合IFN-γ刺激巨噬細(xì)

17、胞后，MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)明顯上調(diào)，而ADSC共培養(yǎng)組顯示出相對(duì)低的表達(dá)水平。另外，抑炎分子IL-10的表達(dá)在ADSC共培養(yǎng)后也明顯上調(diào)。對(duì)通路分子檢測(cè)的結(jié)果顯示，ADSC可以上調(diào)p-STAT3，p-STAT6的表達(dá)而下調(diào)p-p65的表達(dá)，提示ADSC可以通過(guò)激活STAT3/STAT6通路，抑制NF-κB通路促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果顯示，ADSC可以通過(guò)培養(yǎng)上清作用于巨噬細(xì)胞，使得M1型巨噬細(xì)胞向M2抑炎表型轉(zhuǎn)換。