Sirt1去乙?；疦rf2對(duì)百草枯暴露小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的:提取小鼠AECⅡ細(xì)胞，建立原代AECⅡ細(xì)胞PQ中毒模型，并觀察Sirt1、Nrf2表達(dá)量的改變與PQ作用的劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，探求兩者之間的聯(lián)系。觀察Nrf2蛋白的乙?；?、穩(wěn)定性與Sirt1表達(dá)的關(guān)系，觀察Nrf2與ARE的結(jié)合活性改變與PQ作用的劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。觀察不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后，細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的改變及細(xì)胞凋亡的改變。
　　方法:
　　1.低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法提取小鼠AECⅡ細(xì)胞，臺(tái)

2、盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，免疫熒光鑒定所提取細(xì)胞
　　2.以PCR、Western Blot、Co-IP方法檢測(cè)不同劑量(400μM、800μM、1200μM、1600μM作用24h)、不同時(shí)間（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AECⅡ細(xì)胞Sirt1、Nrf2基因和蛋白水平表達(dá)的改變及Nrf2乙酰化水平的變化，EMSA法檢測(cè)不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ Nrf2與ARE結(jié)合活性的改變，應(yīng)用放線

3、菌酮檢測(cè)Nrf2蛋白穩(wěn)定性的改變。
　　3.化學(xué)比色法檢測(cè)不同劑量(400μ M、800μ M、1200μ M、1600μ M作用24h)、不同時(shí)間（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT、GSH、MDA的改變，ELISA法檢測(cè)不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后小鼠AEC-ⅡHO-1的表達(dá)改變，caspase-3、caspase-9活性試劑盒檢測(cè)不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后小鼠A

4、EC-Ⅱcaspase-3、caspase-9活力的改變，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ凋亡比例的改變，Western Blot檢測(cè)不同劑量、不同時(shí)間PQ作用后小鼠AEC-ⅡCytochrome c蛋白表達(dá)改變。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)低濃度胰酶聯(lián)合Ⅰ型膠原酶消化法分離、純化小鼠AECⅡ，每只小鼠可平均獲得5×106個(gè)細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)細(xì)胞活力90％，免疫熒光特異性蛋白染色證實(shí)所提取細(xì)胞為小鼠A

5、ECⅡ。
　　2.不同時(shí)間、不同劑量PQ作用后Sirt1、Nrf2的基因及蛋白水平的變化保持一致，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，分別在12h、800μM時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。Nrf2的乙?；脚cSirt1蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。不同時(shí)間、不同劑量PQ作用后Nrf2與ARE的結(jié)合活性同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，分別在24h、800μM時(shí)結(jié)合活性達(dá)到峰值，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05

6、)。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，Sirt1的存在，增加了Nrf2的穩(wěn)定表達(dá)。
　　3.PQ作用后抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量隨作用時(shí)間延長(zhǎng)先降低而后回升;隨著PQ作用劑量的加大，抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量先下降后有所回升更大劑量后再次下降，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。HO-1的表達(dá)則隨著PQ作用濃度的增大遞增，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。

7、PQ作用后，MDA含量呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性增加，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。caspase-3、caspase-9的活力隨PQ作用時(shí)間延長(zhǎng)、劑量加大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。PQ作用后細(xì)胞凋亡隨時(shí)間、劑量的增加而增多，但長(zhǎng)時(shí)間、大劑量作用后，細(xì)胞死亡數(shù)超過(guò)凋亡數(shù)。線粒體內(nèi)Cytochrome c蛋白呈現(xiàn)時(shí)間、劑量依賴性降低，胞質(zhì)中其含量與細(xì)胞凋亡趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論:

8、>　　1.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后，Sirt1表達(dá)量升高，通過(guò)其去乙?；饔糜贜rf2，降低了Nrf2的乙酰化水平，使得Nrf2蛋白的表達(dá)量升高，同時(shí)使其穩(wěn)定性增強(qiáng)。
　　2.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后能夠激活線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡途徑，使細(xì)胞凋亡增多，凋亡蛋白表達(dá)升高，脂質(zhì)過(guò)氧化損傷加重。PQ作用后Nrf2在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量升高、穩(wěn)定性增強(qiáng)，并且與ARE特異性結(jié)合的能力增強(qiáng)，繼而調(diào)節(jié)位于下游的抗氧化物HO-1、SOD、CAT、GSH