丹酚酸B通過(guò)SIRT1對(duì)p53去乙酰化保護(hù)急性酒精所致的大鼠肝損傷.pdf

1、背景:急性酒精不僅會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生一種急性的毒性影響，也對(duì)慢性酒精性肝病的形成起到了促進(jìn)作用。有研究表明，SIRT1在酒精性肝病中發(fā)揮了重要作用，而其在急性酒精所介導(dǎo)的肝損傷中的作用未見(jiàn)報(bào)道。丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是一種多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。已有文獻(xiàn)證實(shí)丹酚酸B具有抵抗肝臟損傷的作用，但丹酚酸B是否能夠通過(guò)調(diào)控SIRT1信號(hào)通路在急性酒精性肝損傷中發(fā)揮作用目前未見(jiàn)報(bào)道。
　

2、　目的:研究丹酚酸B對(duì)急性酒精所致大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。從分子水平探索其作用與SIRT1相關(guān)通路之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1、丹酚酸B對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究
　　將30只健康成年的雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為以下5組:(A)空白對(duì)照組;(B)丹酚酸B正常給藥組(30mg/kg);(C)急性酒精肝損傷組(6g/kg);(D)低劑量丹酚酸B預(yù)處理組(15mg/kg);(E)高劑量丹酚酸B預(yù)處理組(30m

3、g/kg)。檢測(cè)大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AspartateAminotransferase，AST）、白介素6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumornecrosisα，TNF-α)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSH-PX)、丙二醛(malondialdehy

4、de，MDA)的活性。光鏡下觀察各組動(dòng)物肝臟石蠟切片的組織形態(tài)學(xué)變化。采用Western Blot法和RT-PCR法檢測(cè)肝組織SIRT1、p53、acelyted-p53、PGC-la、NF-κB、Bcl-xL、Cleaved caspase-3、 MnSOD等蛋白水平以及SIRT1的基因表達(dá)水平。采用TUNEL法檢測(cè)肝臟細(xì)胞的凋亡情況。
　　2、丹酚酸B對(duì)酒精損傷的HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　(1)丹酚酸B

5、對(duì)HepG2細(xì)胞酒精損傷的保護(hù)作用
　　HepG2細(xì)胞隨機(jī)分成五組:空白對(duì)照組;急性酒精損傷組(200mM);低、中、高劑量丹酚酸B預(yù)處理組(0.5μM，2μM，8μM)。藥物與細(xì)胞共同孵育3h。
　　(2)丹酚酸B對(duì)SIRT1蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照組;低、中、高濃度丹酚酸B預(yù)處理組(0.5μM，2μM，8μM)。藥物與細(xì)胞共同孵育3h后，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIR

6、T1的蛋白表達(dá)水平。
　　HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照組;丹酚酸B(8μM)藥物作用不同時(shí)間組(0h，1.5h，3h，6h)。藥物與細(xì)胞孵育相應(yīng)時(shí)間后，提取蛋白，采用WesternBlot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1的蛋白表達(dá)水平。
　　(3)丹酚酸B誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)對(duì)p53乙?；恼{(diào)節(jié)作用
　　HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為四組:陰性對(duì)照組(si-Control);陰性對(duì)照+丹酚酸B組(8μM);轉(zhuǎn)染SIRT1 siRN

7、A組;轉(zhuǎn)染SIRT1 siRNA+丹酚酸B組(8μM)。轉(zhuǎn)染后，丹酚酸B給藥作用3h后提取胞核蛋白。Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1及p53、acetyl-p53、PGC-1a的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:急性酒精暴露會(huì)引起大鼠ALT、AST的水平上升，使大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α活性顯著升高，同時(shí)大鼠肝組織中GSH、GSH-PX的活性明顯下降，MDA明顯上調(diào)。而在丹酚酸B預(yù)處

8、理組中，這些現(xiàn)象明顯改善。且丹酚酸B預(yù)處理可上調(diào)Bcl-xL蛋白表達(dá)，降低Cleaved caspase-3及NF-κB蛋白表達(dá)。更重要的是，丹酚酸B預(yù)處理顯著上調(diào)了SIRT1的表達(dá)及活性，降低了乙酰化p53的表達(dá)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，丹酚酸B對(duì)SIRT1的激活作用呈現(xiàn)一定的時(shí)間劑量依賴性，當(dāng)SIRT1基因被干擾后，藥物對(duì)SIRT1蛋白表達(dá)的激活及對(duì)乙?；痯53蛋白表達(dá)的抑制作用消失。以上結(jié)果表明丹酚酸B對(duì)急性酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，并且這