調(diào)節(jié)SIRT1去乙?；傅乃幬镉绊懼惔x及衰老的機(jī)制研究.pdf

1、目前普遍認(rèn)為，肥胖，特別是腹型肥胖是代謝綜合癥的發(fā)生、發(fā)展及診斷中的關(guān)鍵因素。脂類代謝紊亂是代謝綜合征、心血管疾病和糖尿病的重要誘因。過多循環(huán)脂肪酸和非脂肪組織的脂肪沉積增加了組織功能損傷及胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。脂肪組織分泌的炎癥因子，如IL-6，TNF-α，促使機(jī)體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)，氧自由基水平增高，易誘發(fā)各種心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化。因此，改善血脂異常以及減少脂肪沉積有助于緩解病情，減少死亡發(fā)生。
　　 Sirtl是一個(gè)具有N

2、AD依賴的去乙?；饔玫腟irtuins蛋白家族成員。越來越多的研究表明，在營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)方面和應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活調(diào)節(jié)方面，Sirtl蛋白都發(fā)揮非常重要的作用。因此，有觀點(diǎn)提出，Sirtuins蛋白家族將成為代謝綜合征的潛在治療靶標(biāo)。
　　 白藜蘆醇（Resveratrol）作為最早發(fā)現(xiàn)的具有調(diào)節(jié)Sirtl活性的多酚類天然產(chǎn)物，在許多衰老性相關(guān)疾病中顯示出良好的防治效果，如心血管疾病、2型糖尿病。研究顯示，白藜蘆醇聯(lián)合他汀藥物不僅

3、能有效提高降脂療效，而且還增加心肌保護(hù)作用。
　　 小檗堿（Berberine）是具有降血脂作用的異喹啉類生物堿。小檗堿降血脂機(jī)制不同于他汀類藥物，是通過上調(diào)肝細(xì)胞LDLR表達(dá)發(fā)揮降血脂作用的。小檗堿和他汀藥物聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高降脂療效。研究顯示，小檗堿還具有一定的抗氧化作用，但機(jī)制不明確
　　 本研究探索小檗堿和白藜蘆醇聯(lián)合降脂療效以及小檗堿抗氧化作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，為提高小檗堿的臨床降脂的有效性，減少不

4、良反應(yīng)的發(fā)生率提供指導(dǎo)意義。同時(shí)，對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的Sirtl蛋白表達(dá)進(jìn)行初探性研究。
　　 我們選用低劑量小檗堿與白藜蘆醇合用為切入點(diǎn)，研究在高血脂金黃地鼠模型中，白藜蘆醇對(duì)低劑量小檗堿降脂療效的影響。以血清甘油三脂、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示：低劑量小檗堿（25mg/kg）和白藜蘆醇（20mg/kg）分別給藥組都無降血脂作用，但是二者聯(lián)合使用顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降脂作用（p<0.05）。說明小檗堿聯(lián)

5、合白藜蘆醇能提高降脂療效。
　　 通過3T3-L1脂肪細(xì)胞模型來檢測(cè)小檗堿和白藜蘆醇對(duì)脂肪生成的影響，結(jié)果顯示：小檗堿和白藜蘆醇以劑量依賴方式降低脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴生成。12μmol/L和20μmol/L小檗堿分別和25μmol/L白藜蘆醇合用對(duì)減少脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴生成具有一定協(xié)同作用（CDI分別為0.98，0.93）。
　　 下一步我們對(duì)聯(lián)合降脂的機(jī)制進(jìn)行了研究，首先從小檗堿上調(diào)LDLR作用入手，研究白藜蘆醇是否能增加小檗堿

6、上調(diào)LDLR的表達(dá)，結(jié)果顯示：在間接熒光標(biāo)記法和流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，10μmol/L白藜蘆醇和12μmol/L小檗堿聯(lián)合使用組比小檗堿單藥組的平均熒光強(qiáng)度增加了8％，說明與小檗堿單藥比較，白藜蘆醇能夠增強(qiáng)小檗堿上調(diào)LDLR表達(dá)的作用。同時(shí)，免疫印跡的方法檢測(cè)結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果基本一致。其次，我們利用小檗堿具有激發(fā)熒光特性，流式方法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)小檗堿在細(xì)胞內(nèi)累積的影響。結(jié)果顯示：10μmol/L，白藜蘆醇預(yù)處理2h后，肝細(xì)胞內(nèi)小檗堿累

7、積量明顯多于未預(yù)處理的對(duì)照組，增加了16％（p<0.05）。
　　 同時(shí)，我們研究了小檗堿對(duì)Sirtl蛋白水平的影響，對(duì)Sirtl與LDLR表達(dá)之間關(guān)聯(lián)進(jìn)行了初步探討。結(jié)果顯示：1.首次發(fā)現(xiàn)小檗堿在體內(nèi)外都具有上調(diào)肝細(xì)胞Sirtl蛋白表達(dá)的作用。免疫印跡和RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)小檗堿處理后，肝細(xì)胞Sirtl蛋白表達(dá)水平和mRNA豐度明顯增加。2.Sirtl和LDLR蛋白的表達(dá)具有正相關(guān)性。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小檗堿處理能同時(shí)上調(diào)S

8、irtl和LDLR蛋白表達(dá)，而Sirtl特異性抑制劑Sirtinol則能同時(shí)下調(diào)Sirtl和LDLR蛋白表達(dá)
　　 鑒于小檗堿對(duì)Sirtl蛋白表達(dá)上調(diào)作用，我們推測(cè)小檗堿增強(qiáng)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷能力可能是通過上調(diào)Sirtl蛋白表達(dá)體現(xiàn)出來的。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了H2O2誘導(dǎo)年輕人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞（HPF）細(xì)胞早衰實(shí)驗(yàn)、H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)以及H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧自由基產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)，對(duì)小檗堿增強(qiáng)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：1.小檗堿和白藜蘆醇能明顯減少H2O2誘導(dǎo)的年輕人胚肺二倍體細(xì)胞內(nèi)衰老相關(guān)性-β-半乳糖苷酶產(chǎn)生，抵抗H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞衰老樣改變，提高細(xì)胞的存活率。2.20μmol/L小檗堿能增強(qiáng)肝細(xì)胞抵抗H2O2誘導(dǎo)的調(diào)亡，提高細(xì)胞的存活率。免疫印跡檢測(cè)到PARP被剪切的蛋白片段減少，caspase-3活化片段降低，Sirtl表達(dá)未下降。3.20μmol/L小檗堿和10μmol/L白藜蘆醇能保護(hù)H2O2引起的Sirtl表達(dá)下降。4.12

10、μmol/L小檗堿和10μmol/L白藜蘆醇能降低H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生。
　　 我們對(duì)D-半乳糖致衰老模型的建立以及衰老中Sirtl蛋白表達(dá)水平進(jìn)行探索性研究。
　　 我們采用5月齡C57BL/6J小鼠建立D-半乳糖致衰老模型。建模完成后，我們對(duì)小鼠的外觀、體重、血液生化特征、衰老相關(guān)蛋白的變化進(jìn)行觀察和檢測(cè)。結(jié)果顯示：給藥組和對(duì)照組在體重方面沒有明顯差別。但是，在其外觀方面，我們觀察到給藥組出現(xiàn)明顯的

11、毛發(fā)枯黃、白毛數(shù)量較多，行動(dòng)遲緩，自發(fā)性活性減少；在血液生化方面，與對(duì)照組比較，125mg/kg和250mg/kg的D-半乳糖給藥小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）含量均顯著降低（p<0.05），丙二醛（MDA）含量均顯著增加（p<0.05）。在衰老模型小鼠的肝組織，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Sirtl蛋白和Hsp70蛋白表達(dá)均下降。
　　 本論文研究結(jié)果顯示：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇和小檗堿合用能夠增強(qiáng)小檗堿降血脂療效。同時(shí)，在

12、降低脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪聚集方面具有一定協(xié)同效應(yīng)。初步證明白藜蘆醇通過增加肝細(xì)胞內(nèi)小檗堿累積量，從而間接性增加LDLR蛋白表達(dá)量可能與聯(lián)合用藥降脂療效有關(guān)。
　　 2.首次在體內(nèi)外證實(shí)小檗堿具有上調(diào)Sirtl蛋白表達(dá)的作用。初步證明小檗堿能降低低濃度H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞早衰、高濃度H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的存活。而上調(diào)Sirtl蛋白表達(dá)以及減少H2O2誘導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生可能與小檗堿增強(qiáng)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。