TSP-1和TGF-β1表達與糖尿病大鼠多臟器損傷的研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病(diabetes Mellitus，DM)已成為世界上發(fā)病率最高、對人類健康威脅最嚴重的疾病之一。糖尿病所引起的糖代謝紊亂，導(dǎo)致微血管病變，以及高血糖本身對組織細胞的毒害作用，繼而引起一系列并發(fā)癥，包括糖尿病陽痿、糖尿病心肌病和糖尿病性癡呆等。對于糖尿病陽痿，有資料表明，大約一半患者在診斷為糖尿病10年后有可能合并勃起功能障礙(erectile disfunction，ED)，其中約有12％的糖尿病患者

2、ED是其首發(fā)表現(xiàn)。高血糖本身對心肌亦有毒害作用，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者70％以上死于心血管系統(tǒng)疾癮，其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是糖尿病患者的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，危害性大，與糖尿病患者心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)。現(xiàn)已公認，糖尿病心肌病是一個獨立的原發(fā)病，其發(fā)病不依賴于高血壓、冠狀動脈疾病和其他已知心臟疾病。此外糖尿病與認知障礙和癡呆亦有密切相關(guān)性：如在歐洲，糖尿病發(fā)病率在

3、年齡大于65的癡呆患者中是6.4％。Leibson等報道了1455例成年發(fā)病的糖尿病病人中981人經(jīng)一年觀察后，101人產(chǎn)生了癡呆，其中77例為老年性癡呆。
　　 糖尿病上述多器官損傷的機制尚未完全明確，目前認為非酶性糖基化終末產(chǎn)物形成、蛋白激酶C信號通路的激活、氧化應(yīng)激反應(yīng)和已糖胺通路活性增高等具有重要作用。隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)上述糖尿病上述臟器損傷均存在間質(zhì)纖維化、相關(guān)細胞凋亡或突觸可塑性改變等病理變化，因此高血糖狀態(tài)下

4、TSP-1和TGF-β1表達的改變和上述糖尿病患者多臟器損傷之間的關(guān)系引起了我們關(guān)注。血小板反應(yīng)素(Thrombospondin，TSP)，尤其是TSP-1，是重要的生理激活物之一，作為一種大分子的細胞外糖蛋白，最初是在被凝血酶刺激的血小板α顆粒釋放的產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，最新研究證實TSP并非血小板特有，可被腎小球系膜細胞，成纖維細胞等多種細胞分泌，許多組織如腎臟、心臟、軟骨和腦中都有TSP基因產(chǎn)物的表達，是許多不同組織細胞外間質(zhì)的重要成分。

5、研究發(fā)現(xiàn)TSP-1由3條相同肽鏈構(gòu)成的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，每條肽鏈由N端、C端球狀結(jié)構(gòu)域、原膠原同源區(qū)、type1重復(fù)序列、type2重復(fù)序列、type3重復(fù)序列組成。其中type1重復(fù)序列(thrombospondin type1 repeats，TSRs)由3個備解素樣基序(TSR1、TSR2、TSR3)組成。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一個分泌型的多肽信號分子超家族，在

6、哺乳動物組織中存在3種形式的TGF-β，分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1所占比例最高，活性最強。激活的TGF-β可使組織纖維化，引起纖維母細胞遷移，抑制膠原酶和其它金屬蛋白酶的活性，增加膠原產(chǎn)生，降低膠原降解，促進基質(zhì)沉積。研究表明，TSP-1分子KRFK序列可與L-TGF-β1的LAP區(qū)域結(jié)合，從而改變LAP的空間構(gòu)型，使TGF-β1上與受體結(jié)合的位點暴露，成為活化的TSP-1/L-TGF-β1。同時新

7、近研究發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)的血小板反應(yīng)素與突觸的建立活化和形態(tài)功能可塑性改變均有密切關(guān)系。因此，我們提出如下假設(shè)：糖尿病狀態(tài)(如高糖等刺激)條件下引起體內(nèi)各類細胞TSP-1和TGF-β1表達的改變，從而促進上述細胞纖維和膠原增生，最后導(dǎo)致纖維化，進而引起糖尿病勃起功能障礙、糖尿病心肌病，此外TSP-1表達改變在海馬區(qū)亦可引起突觸可塑性的改變，因此上述通路改變亦可引起糖尿病學(xué)習(xí)記憶能力的下降。
　　 研究已經(jīng)表明，在哺乳動物中小干擾RNA(

8、siRNA)能通過對生物學(xué)上保守結(jié)構(gòu)的RNA進行干擾，從而抑制相應(yīng)靶基因的表達。RNA干擾具有高度的序列特異性，能使靶蛋白的表達關(guān)閉。許多研究已經(jīng)證實RNA干擾能阻斷多種類型哺乳動物病毒的復(fù)制，抑制癌腫的生長。RNA干擾已經(jīng)被開發(fā)成為反向遺傳學(xué)的一個強有力的工具，并且已顯示出廣闊的治療學(xué)上的應(yīng)用前景。因此，我們有理由假設(shè)針對性開發(fā)TSP-1的小干擾RNA無疑對高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元的損傷有一定的保護作用。
　　 我們通過研究高血糖狀

9、態(tài)下對海馬區(qū)神經(jīng)元TSP-1和TGF-β1的表達改變，同時設(shè)計siRNA對TSP-1的表達進行了基因沉默，并評估TSP-1表達下調(diào)對神經(jīng)元的形態(tài)及突觸形成的影響。期望能靶向干擾TSP-1表達，為搪尿病學(xué)習(xí)記憶能力下降的基因治療提供一定的體外實驗依據(jù)。
　　 第一部分：TSP-1和TGF-β1在糖尿病大鼠陰莖、心肌和海馬區(qū)表達改變的研究
　　 1、目的：
　　 研究TSP-1和TGF-β1蛋白和mRNA在糖尿病大鼠

10、陰莖、心肌和海馬區(qū)表達的改變情況，初步闡明TSP-1和TGF-β1通路參與了糖尿病大鼠高血糖狀態(tài)下的上述臟器損傷。
　　 2、材料與方法：
　　 2.1、糖尿病大鼠模型的制備
　　 SD大鼠隨機分為糖尿病組和正常對照組，其中糖尿病組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)65mg/kg制成糖尿病模型，定期測尿糖、血糖及體重，以確保維持高血糖狀態(tài)。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，其余條件同上，

11、喂養(yǎng)6周。
　　 2.2、各臟器功能檢測
　　 2.2.1、行為學(xué)檢測
　　 成模6周后各組大鼠分別進行Morris水迷宮實驗(觀察指標為逃避潛伏期和搜索策略)，以檢測糖尿病動物的學(xué)習(xí)、記憶能力的變化。
　　 2.2.2、陰莖勃起功能檢測
　　 成模6周后各組大鼠采用頸部皮下注射鹽酸阿樸嗎啡(APO)溶液(150ug/kg)，劑量約1ml，持續(xù)觀察30min，對其陰莖勃起情況進行檢測。
　　

12、 2.2.3、心功能檢測
　　 成模6周后各組大鼠充分麻醉后處死開胸，迅速取出心臟，置于4℃K-H液中除去血液，然后迅速轉(zhuǎn)移并固定于Langendorff灌流裝置上，用改良K-H液行常規(guī)逆行恒壓灌注(76mmHg)，觀察平衡灌注末的心臟作功量(rate-pressureproduct，RPP)，即心率*左室發(fā)展壓(HR*LVDP)的變化。
　　 2.3、各臟器組織的病理變化觀察
　　 成模6周后各組大鼠麻醉處死

13、，分別取陰莖組織、心臟和腦，制作石蠟切片，HE染色觀察其病理改變，同時取心臟和海馬區(qū)組織塊制作電鏡包埋和切片，電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 2.4、免疫組化和實時熒光定量PCR法檢測TSP-1和TGF-β1的表達
　　 成模6周后各組大鼠麻醉處死，分別取陰莖組織、心臟和腦，制作石蠟切片，采用免疫組化ABC法觀察上述各組織TSP-1和TGF-β1蛋白的表達，同時Trizol試劑盒提取細胞總RNA，隨后逆轉(zhuǎn)錄合成cDN

14、A，rt-qPCR法檢測TSP-1和TGF-β1的基因轉(zhuǎn)錄情況。
　　 2.5、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1、體重、血糖和尿糖檢測結(jié)果
　　 各組大鼠成模前，其體重、血糖和尿糖檢測結(jié)果兩組間無顯著性差異，成模6周后，糖尿病組體重251.6±27.4g，血

15、糖基本維持在19.8±2.8mmol/L，尿糖為++～+++。正常組大鼠體重397.4±21.3g，血糖為5.1±0.5mmol/L，尿糖陰性。兩組差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　 3.2、各臟器功能
　　 行為學(xué)Morris水迷宮實驗顯示，正常組大鼠第1天的逃避潛伏期為(40.1±26.0)s；第2天為(24.8±14.2)s；第3天為(13.4±4.8)s；穿臺次數(shù)為(6.1±3.8)；糖尿病組大鼠第1天的逃

16、避潛伏期為(71.6±33.7)s；第2天為(43.4±13.8)s；第3天為(26.9±19.1)s，穿臺次數(shù)為(3.2±1.3)，上述差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　 檢測其陰莖勃起功能發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠單位時間勃起次數(shù)和勃起率(1.4±0.5次/30min和40％)明顯低于正常對照組大鼠(2.4±0.8次/30min和100％)(P<0.01)。
　　 心功能檢測顯示糖尿病組大鼠RPP值明顯低于正常組大鼠，(

17、P<0.01)。
　　 3.3、各臟器病理改變
　　 各臟器組織HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠陰莖白膜厚度的增加，陰莖膠原纖維破壞，失去了其特有的起伏的外觀，同時內(nèi)皮和平滑肌細胞也退化及間質(zhì)細胞增殖。糖尿病大鼠心肌細胞有不同程度的間質(zhì)纖維化和心肌肥厚，心肌纖維出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)性的稀疏。電鏡下可見糖尿病大鼠心肌微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破壞，心肌細胞肌原纖維片狀壞死、溶解，肌小節(jié)失去正常結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)心肌細胞凋亡或壞死等現(xiàn)象。糖尿病大鼠海馬區(qū)電

18、鏡觀察可見神經(jīng)元內(nèi)部線粒體嵴消失，神經(jīng)元之間突觸結(jié)構(gòu)蛻變，同時海馬區(qū)單位面積突觸數(shù)目明顯少于正常組大鼠。
　　 3.4、免疫組化和rt-PCR檢測結(jié)果
　　 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠各組織中TSP-1和TGF-β1的蛋白表達較正常對照組均明顯上調(diào)，其中糖尿病組大鼠陰莖、心臟和海馬區(qū)TSP-1和TGF-β1的單位面積陽性細胞數(shù)量均明顯高于正常對照組(P<0.05)，同時和實時熒光定量PCR法結(jié)果顯示TSP-1和TGF-

19、β1mRNA表達較正常對照組亦明顯上調(diào)(分別是對照組的2.8folds，1.7folds，6.6folds和6.9folds，4.3folds，1.42folds)。
　　 4、結(jié)論：
　　 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠出現(xiàn)血糖增高、尿糖強陽性、體重增加不明顯等一般情況改變，而且大鼠勃起功能、心功能和學(xué)習(xí)記憶能力均不同程度下降，同時伴陰莖、心臟和海馬區(qū)不同程度的病理改變，此外糖尿病大鼠各組織中TSP-1和TGF-β1的蛋白和m

20、RNA表達較正常對照組大鼠亦明顯上調(diào)。
　　 第二部分：siRNA靶向干擾TSP-1對高血糖培養(yǎng)神經(jīng)元形態(tài)和TSP-1表達改變的影響
　　 1、目的：
　　 明確siRNA靶向干擾TSP-1可有效改善高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元形態(tài)改變和TSP-1/TGF-β1的表達，以及保護神經(jīng)元形態(tài)和突觸連接。
　　 2、材料與方法：
　　 2.1、細胞培養(yǎng)
　　 取孕16天SD大鼠，0.5％戊巴比妥鈉麻醉，打

21、開子宮，取出胎鼠，取大腦并分離海馬。研磨組織并通過200目的濾網(wǎng)，收集細胞懸液，離心、重懸。接種于1×Polylysine包被的6孔培養(yǎng)板以及有小圓玻片的48孔培養(yǎng)板中，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨機分為正常培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)+轉(zhuǎn)染組、高糖培養(yǎng)+陰行轉(zhuǎn)染組、高糖培養(yǎng)+空白轉(zhuǎn)染組。
　　 2.2、siRNA制備與轉(zhuǎn)染
　　 各對siRNA序列如下TSP-1sence
　　 5’-UACACUUGG

22、CACCAGCAAAGCAGGG-3’，LacZ引物序列上游引物
　　 5’-ACCAGAAGCGGRGCCGGAAA-3’下游引物
　　 5’-CCACAGCGGATGGTTCGGAT-3’，上述siRNA由英維捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。上述細胞準備后，進行轉(zhuǎn)染，而后輕輕振蕩混勻，5％二氧化碳、37℃濕化空氣中常規(guī)培養(yǎng)48小時。
　　 2.3、掃描電鏡觀察
　　 上述細胞培養(yǎng)48小時后，吸干鋪有小圓

23、玻片48孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，4℃生理鹽水洗1次，2.5％戊二醛固定1h，0.01MPBS洗2次，每次15min，1％鋨酸固定1h，0.1MPBS溶液漂洗2次，每次15分鐘。梯度酒精脫水，100％丙酮脫水20min。用50％醋酸異戊酯置換15min，100％醋酸異戊酯置換15min，臨界點干燥，粘臺，鍍金，上機觀察。
　　 2.4、免疫組化檢測及WesternBlot檢測
　　 上述細胞培養(yǎng)48小時后，0.01MPBS含0

24、.3％的TRITONX-100(pH值7.4，PBS-T)分別洗凈，然后沉浸含2％正常山羊血清的PBS2小時，TSP-1或TGF-β1抗體(1:100)和含有1％的牛血清白蛋白的PBS中4℃過夜，PBS(3×5min)洗凈，生物素標記的羊抗兔IgG(1:200)孵育4h，PBS(3×5min)洗凈，免疫標記diaminobenzdine0.05％，加0.3％H2O2的PBS，染色，鏡下控制反應(yīng)時間，然后用乙醇和二甲苯梯度脫水。其中PBS

25、被用來代替一抗作為陰性對照。
　　 等量提取的蛋白裝載到SDS/PAGE膠上并被分離后，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用含有5％脫脂奶粉的TBST液封閉1小時，再分別用TSP-1或TGF-β1抗體(1:100)在常溫下孵育，膜用TBST液洗滌4次，然后用抗鼠IgG-HRP(DAKO)在常溫下孵育1小時，最后蛋白用ECL體系進行檢測。蛋白相對表達量=待測蛋白的光密度值/內(nèi)參的光密度值。
　　 2.5、統(tǒng)計學(xué)分析
　　

26、所有數(shù)值以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組之間采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。
　　 3、結(jié)果：
　　 3.1、掃描電鏡觀察
　　 各組培養(yǎng)細胞掃描電鏡可見，正常組神經(jīng)元表面細胞微絨毛結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元間聯(lián)系廣泛而緊密，高糖培養(yǎng)組神經(jīng)元細胞表面微絨毛結(jié)構(gòu)缺失，伴脫落，細胞膜可見輕微破損，神經(jīng)元間聯(lián)系稀疏，而RNA轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元上述病變較輕，同時陰性轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元顯示和高糖培

27、養(yǎng)組程度類似的損傷。
　　 3.2、免疫組化檢測及WesternBlot檢測結(jié)果
　　 通過檢測神經(jīng)元TSP-1和TGF-β1蛋白表達來評估TSP-1siRNA對神經(jīng)元上述蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSP-1siRNA轉(zhuǎn)染組TSP-1和TGF-β1蛋白的表達與高糖培養(yǎng)組相比顯著地減少(P<0.01)。
　　 4、結(jié)論：
　　 通過siRNA靶向干擾TSP-1能有效改善高血糖狀態(tài)下神經(jīng)元形態(tài)改變和TSP-1和