CHO細(xì)胞表達(dá)的重組OCILRP2蛋白的研制.pdf

1、背景
　　 C型凝集素樣受體如NKG2D和CD94/NKG2由于它們共刺激T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的能力而被認(rèn)為是一種新的T細(xì)胞刺激分子。C型凝集素家族具有獨(dú)特的糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域(cysteine rich domain，CRD)，這種糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域被稱為C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域。
　　 實(shí)驗(yàn)表明，C型凝集素樣分子，包括NK細(xì)胞受體CD94/NKG2A和NKG2D，NKRP1家族成員和CD69，在先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中扮演重要角

2、色。通過(guò)與其配體相互結(jié)合，C型凝集素樣受體能夠在NK細(xì)胞和其他細(xì)胞中扮演多種角色。C型凝集素受體成員在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，病原體識(shí)別調(diào)節(jié)，NK細(xì)胞和T細(xì)胞的刺激，細(xì)胞運(yùn)輸和骨的形成。
　　 破骨細(xì)胞抑制凝集素相關(guān)蛋白2(osteoclast inhibitory lectinrelated protein 2，OCILRP2)是破骨細(xì)胞抑制凝集素(OCIL)家族的成員之一，屬于Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有較小的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)，OCI

3、L家族成員的胞外區(qū)均包含一個(gè)C型凝集素樣的結(jié)構(gòu)域。OCILRP2是一種新的C型凝集素。小鼠OCILrP2基因位于6號(hào)染色體的NK基因復(fù)合體內(nèi)。OCIL家族包括OCIL(Clrb)、OCILrP1(Clrd)和OCILrP2(Clrg)3個(gè)基因，其胞外區(qū)具有很高的同源性(約80％)。
　　 OCILRP2主要在免疫組織器官中表達(dá)，在小鼠脾臟和胸腺中高水平表達(dá)，在其他器官如大腦、心臟、肝臟、腎臟、睪丸、肺、胎盤和肌肉等均未檢測(cè)到OC

4、ILRP2的表達(dá)：其中主要在B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)中呈高表達(dá)，在未活化的T細(xì)胞中幾乎很少表達(dá)。但在T細(xì)胞被活化后其表達(dá)水平明顯上升。初步研究表明，OCILRP2可作為T細(xì)胞的共刺激分子，在T細(xì)胞的活化過(guò)程中發(fā)揮一定作用，且OCILRP2是與其配體NKRP1f相互配合在T細(xì)胞的活化過(guò)程中發(fā)揮共刺激作用的。
　　 T細(xì)胞活化能夠快速誘導(dǎo)OCILRP2的產(chǎn)生，并在72小時(shí)內(nèi)保持相當(dāng)高的水平。OCILRP2的配體NKRP1f在樹(shù)突狀

5、細(xì)胞顯著表達(dá)?？扇苄缘腛CILRP2-IgFc重組蛋白能夠在體內(nèi)和體外顯著抑制特異性抗原刺激對(duì)T鄉(xiāng)Ⅲ胞的增蚺，白介素2(IL-2)的產(chǎn)生；相反，抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)的NKRP1f通過(guò)與OCILRP2共刺激增強(qiáng)B7.1/CD28介導(dǎo)的T細(xì)胞的增值。但是有關(guān)OCILRP2在T細(xì)胞共刺激中的作用機(jī)制目前尚不清楚。
　　 目的
　　 探討OCILRP2-IgFc融合蛋白在哺乳動(dòng)物中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中的穩(wěn)定分泌表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物

6、的純化和鑒定，利用純化鑒定后的OCILRP2-IgFc融合蛋白免疫宿主動(dòng)物制備特異性的抗OCILRP2抗體。
　　 方法
　　 利用脂質(zhì)體2000為轉(zhuǎn)染媒介，將OCILRP2-IgFc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO細(xì)胞，經(jīng)G418抗性培養(yǎng)基加壓篩選、克隆化培養(yǎng)、ELISA測(cè)定，獲得穩(wěn)定表達(dá)OCILRP2-IgFc融合蛋白的細(xì)胞克?。?br>　　 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，適時(shí)更換無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組織培養(yǎng)基，繼

7、續(xù)培養(yǎng)5-7天后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清經(jīng)低溫高速離心和0.45微米濾膜過(guò)濾后上Protein A柱進(jìn)行親和層析純化：利用BCA、SDS-PAGE、Western blot、ELISA、質(zhì)譜分析等方法對(duì)純化得到的融合蛋白濃度、純度、分子量、抗原特異性進(jìn)行測(cè)定和鑒定。使用流式細(xì)胞術(shù)及ELISA等檢測(cè)方法對(duì)獲得的重組蛋白OCILRP2的生物學(xué)活性進(jìn)行分析。
　　 用純化得到的OCILRP2-IgFc融合蛋白加弗氏完全佐劑(CFA)或不

8、完全佐劑(IFA)乳化免疫雄性的新西蘭白兔制備抗OCILRP2的抗血清，利用飽和硫酸銨(SAS)鹽析和ProteinG親和層析純化獲得特異性抗OCILRP2的多克隆抗體。
　　 結(jié)果
　　 建立穩(wěn)定分泌表達(dá)OCILRP2-IgFc融合蛋白的CHO細(xì)胞系。利用Protein A親和層析純化獲得OCILRP2-IgFc融合蛋白，SDS-PAGE可見(jiàn)兩條蛋白主帶，一條分子量為55kDa，另一條分子量為40kDa，Western

9、 blot可在同樣位置檢測(cè)到該兩條蛋白與HRP標(biāo)記的山羊抗人Ig/Fc抗體特異性結(jié)合，將上述兩條蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析均含有OCILRP2和標(biāo)簽Fc的氨基酸序列，證實(shí)純化得到的蛋白為OCILRP2-IgFc融合蛋白。制備的OCILRP2-IgFc融合蛋白能有效抑制T細(xì)胞增殖、IL-2的分泌、OCILRP2表達(dá)等。ELISA、Western blot均證實(shí)制備的兔抗OCILRP2抗體與純化得到的融合蛋白OCILRP2-IgFc的兩個(gè)主條帶發(fā)