重組蛋白2-SH2的表達、純化、結(jié)構(gòu)分析及應(yīng)用.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacte.pylori，Hp)是引發(fā)胃癌、胃腺癌、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等疾病的主要致病菌。幽門螺桿菌的毒力因子之一cagA蛋白能與寄主細胞的信號傳導分子相互作用，引起細胞病變，例如：細胞的增殖、移動、凋亡及形態(tài)的改變等。SHP-2即為此類信號傳導蛋白，一些由幽門螺桿菌引起的胃病的發(fā)病機理可能與SHP-2的不正確活化有關(guān)。幽門螺桿菌侵染人胃上皮細胞，毒性決定因子cagA蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化并

2、聚集在SHP-2周圍，使SHP-2得到活化，信號傳導通路也因此發(fā)生改變。
　　 SH2結(jié)構(gòu)域普遍存在于高等真核生物功能不同的蛋白中。迄今為止發(fā)現(xiàn)含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白約110余種，此結(jié)構(gòu)域的主要功能是致使信號復(fù)合體聚集。SH2結(jié)構(gòu)域蛋白同樣也存在于SHP-2中，是由大約100個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域。SHP-2蛋白有一前一后相鄰的兩個SH2結(jié)構(gòu)域，其中N-SH2由102個氨基酸組成，C-SH2由105個氨基酸組成。由Glu-Pro-

3、Ile-Tyr-Alu五個連續(xù)的氨基酸共同組成基序我們稱之為EPIYA序列，其是cagA蛋白的主要致病序列，也是磷酸化酪氨酸的典型代表。EPIYA序列能夠引起胃上皮細胞的病變，通過SH2結(jié)構(gòu)域，大量SHP-2磷酸酯酶得以聚集并與酪氨酸磷酸化EPIYA序列特異結(jié)合形成復(fù)合體，這個過程能夠引起SHP-.N-端SH.(N-SH2)結(jié)構(gòu)域發(fā)生變構(gòu)現(xiàn)象，從而提高SHP-2磷酸酯酶的酶活性。
　　 本論文描述了表達、純化和結(jié)構(gòu)檢測2-SH2

4、蛋白的方法，應(yīng)用大腸桿菌表達人類SHP-2磷酸酯酶中的2-SH2結(jié)構(gòu)域蛋白并進行純化及結(jié)構(gòu)分析，旨在表達及純化出具有識別活性并且折疊結(jié)構(gòu)正確的高質(zhì)量2-SH2。這對篩選出毒力因子cagA蛋白的治病序列起到舉足輕重的作用，同時也揭示Hp病原蛋白與寄主細胞信號傳導蛋白間互作的分子機制及cagA陽性株系與Hp致病性間的關(guān)系，為開發(fā)Hp早期診斷芯片和預(yù)防胃癌的分子藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 依據(jù)GenBank提供的人類SHP-2的2-SH2序

5、列信息，設(shè)計并合成特異性引物用于隨后進行的載體重建。將2-SH2序列插入pGEX-2T載體后，通過測序和生物信息學分析對重建表達載體進行檢測。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中培養(yǎng)并挑取陽性克隆用于表達。采用LB培養(yǎng)基進行表達預(yù)實驗，通過時間梯度和IPTG濃度梯度條件實驗，重組質(zhì)粒經(jīng)誘導表達出預(yù)期分子量大小為51 kDa的(含N-SH2及C-SH2兩結(jié)構(gòu)域)融合蛋白。在優(yōu)化條件下再采用含15N同位素的M9培養(yǎng)基對蛋白培養(yǎng)表達，結(jié)果

6、顯示該融合蛋白在M9培養(yǎng)基中的表達與LB培養(yǎng)基表達一致，產(chǎn)量較高而穩(wěn)定。將2-SH2融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切及純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示GST-2-SH2融合蛋白、GST融合蛋白標簽和2-SH2蛋白表達純化結(jié)果良好，分子量大小與預(yù)期值一致，分別為51 kDa，2.kDa和25 kDa。純化后的2-SH2蛋白樣品用于Western-blotting和質(zhì)譜檢測。Western-blotting結(jié)果表明純化并酶切后的蛋白樣品能夠與

7、兔抗小鼠SHP-2/SHPTP-2多抗特異性識別結(jié)合，在目標區(qū)域出現(xiàn)特異性雜合條帶。SELDI-TOF-MS檢測結(jié)果顯示被檢測蛋白分子量為25-.kDa，與理論值(25.66kDa)相一致。經(jīng)過一系列檢測確認的2-SH2蛋白樣品經(jīng)濃縮定量后進行核磁共振結(jié)構(gòu)檢測。NMR三維結(jié)構(gòu)和活性位點的分析結(jié)果表明，目的蛋白正確折疊并呈規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)。
　　 綜上所述，經(jīng)上述表達純化方法獲得的蛋白具有天然的折疊結(jié)構(gòu)，可以應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)域芯片和靶