版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、幽門螺桿菌(Helicobacte.pylori,Hp)是引發(fā)胃癌、胃腺癌、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等疾病的主要致病菌。幽門螺桿菌的毒力因子之一cagA蛋白能與寄主細胞的信號傳導分子相互作用,引起細胞病變,例如:細胞的增殖、移動、凋亡及形態(tài)的改變等。SHP-2即為此類信號傳導蛋白,一些由幽門螺桿菌引起的胃病的發(fā)病機理可能與SHP-2的不正確活化有關(guān)。幽門螺桿菌侵染人胃上皮細胞,毒性決定因子cagA蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化并
2、聚集在SHP-2周圍,使SHP-2得到活化,信號傳導通路也因此發(fā)生改變。
SH2結(jié)構(gòu)域普遍存在于高等真核生物功能不同的蛋白中。迄今為止發(fā)現(xiàn)含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白約110余種,此結(jié)構(gòu)域的主要功能是致使信號復(fù)合體聚集。SH2結(jié)構(gòu)域蛋白同樣也存在于SHP-2中,是由大約100個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域。SHP-2蛋白有一前一后相鄰的兩個SH2結(jié)構(gòu)域,其中N-SH2由102個氨基酸組成,C-SH2由105個氨基酸組成。由Glu-Pro-
3、Ile-Tyr-Alu五個連續(xù)的氨基酸共同組成基序我們稱之為EPIYA序列,其是cagA蛋白的主要致病序列,也是磷酸化酪氨酸的典型代表。EPIYA序列能夠引起胃上皮細胞的病變,通過SH2結(jié)構(gòu)域,大量SHP-2磷酸酯酶得以聚集并與酪氨酸磷酸化EPIYA序列特異結(jié)合形成復(fù)合體,這個過程能夠引起SHP-.N-端SH.(N-SH2)結(jié)構(gòu)域發(fā)生變構(gòu)現(xiàn)象,從而提高SHP-2磷酸酯酶的酶活性。
本論文描述了表達、純化和結(jié)構(gòu)檢測2-SH2
4、蛋白的方法,應(yīng)用大腸桿菌表達人類SHP-2磷酸酯酶中的2-SH2結(jié)構(gòu)域蛋白并進行純化及結(jié)構(gòu)分析,旨在表達及純化出具有識別活性并且折疊結(jié)構(gòu)正確的高質(zhì)量2-SH2。這對篩選出毒力因子cagA蛋白的治病序列起到舉足輕重的作用,同時也揭示Hp病原蛋白與寄主細胞信號傳導蛋白間互作的分子機制及cagA陽性株系與Hp致病性間的關(guān)系,為開發(fā)Hp早期診斷芯片和預(yù)防胃癌的分子藥物奠定基礎(chǔ)。
依據(jù)GenBank提供的人類SHP-2的2-SH2序
5、列信息,設(shè)計并合成特異性引物用于隨后進行的載體重建。將2-SH2序列插入pGEX-2T載體后,通過測序和生物信息學分析對重建表達載體進行檢測。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中培養(yǎng)并挑取陽性克隆用于表達。采用LB培養(yǎng)基進行表達預(yù)實驗,通過時間梯度和IPTG濃度梯度條件實驗,重組質(zhì)粒經(jīng)誘導表達出預(yù)期分子量大小為51 kDa的(含N-SH2及C-SH2兩結(jié)構(gòu)域)融合蛋白。在優(yōu)化條件下再采用含15N同位素的M9培養(yǎng)基對蛋白培養(yǎng)表達,結(jié)果
6、顯示該融合蛋白在M9培養(yǎng)基中的表達與LB培養(yǎng)基表達一致,產(chǎn)量較高而穩(wěn)定。將2-SH2融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切及純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果顯示GST-2-SH2融合蛋白、GST融合蛋白標簽和2-SH2蛋白表達純化結(jié)果良好,分子量大小與預(yù)期值一致,分別為51 kDa,2.kDa和25 kDa。純化后的2-SH2蛋白樣品用于Western-blotting和質(zhì)譜檢測。Western-blotting結(jié)果表明純化并酶切后的蛋白樣品能夠與
7、兔抗小鼠SHP-2/SHPTP-2多抗特異性識別結(jié)合,在目標區(qū)域出現(xiàn)特異性雜合條帶。SELDI-TOF-MS檢測結(jié)果顯示被檢測蛋白分子量為25-.kDa,與理論值(25.66kDa)相一致。經(jīng)過一系列檢測確認的2-SH2蛋白樣品經(jīng)濃縮定量后進行核磁共振結(jié)構(gòu)檢測。NMR三維結(jié)構(gòu)和活性位點的分析結(jié)果表明,目的蛋白正確折疊并呈規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)。
綜上所述,經(jīng)上述表達純化方法獲得的蛋白具有天然的折疊結(jié)構(gòu),可以應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)域芯片和靶
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- PRRS病毒ORF2~5基因的原核表達及重組蛋白的純化.pdf
- 組蛋白H2A衍生抗菌肽的重組表達及活性分析.pdf
- 生殖支原體MgPa重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究.pdf
- 糞腸球菌Ace重組蛋白的表達、純化及黏附活性研究.pdf
- PTD-SH2融合蛋白的原核表達和純化.pdf
- 人體MDM2蛋白的重組表達,純化及鑒定研究.pdf
- 條斑紫菜TPS基因的原核表達及重組蛋白的純化.pdf
- 弓形蟲P30重組蛋白的表達、純化及診斷應(yīng)用研究.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因表達及重組蛋白ELISA方法的建立.pdf
- 肺炎嗜衣原體CPAF重組蛋白的表達、純化及其臨床診斷初步應(yīng)用.pdf
- 28307.重組蛋白ggh在畢赤酵母中高效表達及純化
- 基于逆向相變和自裂解的重組蛋白表達和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用.pdf
- 轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白質(zhì)的純化及活性檢測.pdf
- hTFPI重組蛋白表達條件的優(yōu)化.pdf
- HER2靶向重組蛋白候選藥物e23sFv-Fdt-tBid的表達純化工藝研究.pdf
- 12412.elp特性研究及elp標簽在重組蛋白純化中的應(yīng)用
- 火菇素cDNA基因的原核表達與重組蛋白的純化及活性研究.pdf
- 幽門螺桿菌CagA和VacA重組蛋白的表達、純化及抗原性檢測.pdf
- 趨化因子受體ccr5胞外段重組蛋白的克隆、表達、純化及鑒定
- 梅毒螺旋體Tp0453重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究.pdf
評論
0/150
提交評論