表達rhTNFR-Fc的重組CHO細胞懸浮馴化及培養(yǎng)工藝研究.pdf

1、重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(rhTNFR-Fc)在治療風濕性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等方面具有顯著療效，并日益顯示出其重要作用和廣闊的市場前景。隨著細胞融合技術(shù)及基因工程的發(fā)展，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已成為生物制藥走向產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)之一。然而宿主細胞的產(chǎn)物表達水平、生產(chǎn)規(guī)模以及培養(yǎng)模式的局限阻礙了該藥物在中國市場的推廣。本課題以表達rhTNFR-Fc的CHO細胞為研究對象，通過選擇營養(yǎng)均衡的培養(yǎng)基，并建立合理的控制策略，從

2、而提高CHO細胞的細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量，為接下來的rhTNFR-Fc融合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　選擇不同的凍存劑對CHO細胞的凍存和復(fù)蘇有影響。與常規(guī)液氮法凍存的細胞相比較，2℃～8℃冰箱中短時間內(nèi)保存CHO細胞懸液在快速恢復(fù)細胞生長狀態(tài)方面存在較大優(yōu)勢，在生產(chǎn)過程循環(huán)周期較緊張的情況下可作為輔助方法用于保障細胞傳代的延續(xù)。CHO細胞復(fù)蘇試驗中，選用40℃下先溶解，再37℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇的方法，加快了凍存細胞的解凍時間

3、，提高了細胞的存活率。
　　CHO細胞經(jīng)過逐步減血清懸浮馴化，細胞的適應(yīng)狀態(tài)較直接無血清馴化的狀態(tài)好，細胞密度能達到2.51×106 cells/mL，比無血清馴化細胞密度提高將近1.6倍。
　　細胞馴化懸浮過程中，添加半胱氨酸鹽酸鹽能夠促進細胞的生長，由表達水平分析顯示，添加半胱氨酸鹽酸鹽能提高細胞表達，與對照組相比表達水平約提高1.7倍。與此同時，培養(yǎng)基中添加硫酸葡聚糖有助于降低細胞結(jié)團，同時提高細胞密度，并確定硫酸葡聚

4、糖的最佳添加濃度為50μg/mL。
　　基礎(chǔ)培養(yǎng)基研究實驗中，CHO細胞在BD、GIBCO和LONZA及E001等四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長，細胞培養(yǎng)5天后進行純化，細胞在E001培養(yǎng)基的表達為41.94mg/L，而LONZA培養(yǎng)基培養(yǎng)的產(chǎn)物表達量為29.96 mg/L。
　　CHO細胞在表達期溫度控制在37℃時，蛋白表達量要高于控溫在32℃時的細胞蛋白表達量。通過表達期滲透壓實驗發(fā)現(xiàn)，細胞表達期的滲透壓控制在390 mOsm/k

5、g較合適。
　　培養(yǎng)方式的研究實驗表明，補料分批培養(yǎng)中補加F001能夠更好的促進生長及表達，產(chǎn)物表達比分批培養(yǎng)提高了一倍多。最終確定CHO細胞適合補料分批培養(yǎng)方式，基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇E001培養(yǎng)基，補料培養(yǎng)基選擇F001培養(yǎng)基。
　　通過本課題的研究，對表達重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白的CHO細胞的懸浮馴化及培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，對于提高細胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)量具有十分重要的作用和意義。為接下來進行rhTNFR-Fc融合蛋白的工