PcG蛋白EZH2、Bmi-1及MiR-203協(xié)同調(diào)控在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、第一部分EZH2、Bmi-1及miR-203在肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用
　　【目的】
　　通過分析肝癌肝移植患者臨床病理特征和EZH2、Bmi-1及MiR-203在肝癌組織中的表達(dá)情況,探討EZH2、Bim-1及miR-203與肝癌肝移植后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,以期得到更加全面客觀的肝癌肝移植的術(shù)前病例篩選標(biāo)準(zhǔn),良好預(yù)測肝癌肝移植的預(yù)后。
　　【方法】
　　1.搜集2007.1-2011.1在我院行肝癌肝移

2、植64例患者病例資料,包括年齡、腫瘤大小、個(gè)數(shù)、TNM分級(jí)、病理分級(jí)、是否血管轉(zhuǎn)移,AFP指標(biāo)、肝炎肝硬化背景、復(fù)發(fā)時(shí)間、生存時(shí)間。
　　2.RT-PCR,Westernblot和免疫組化分析EZH2,Bmi-1在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平在肝癌病人組織中的表達(dá)。
　　3.RT-PCR檢測病人肝癌組織中miR-203表達(dá)。
　　4.單變量分析及多因素分析分析EZH2和Bmi-1及miR-203的表達(dá)與肝癌移植術(shù)后生存率及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)

3、移的相關(guān)性。
　　【結(jié)果】
　　1.所有癌組織中Bmi-1、EZH2在mRNA水平及蛋白水平均有表達(dá),且在移植后復(fù)發(fā)癌組織中的表達(dá)要高于未復(fù)發(fā)癌組織(P<0.0001);所有肝癌組織中miR-203均有表達(dá),未復(fù)發(fā)組織表達(dá)高于復(fù)發(fā)癌組織(P<0.0001);低表達(dá)Bmi-1、EZH2,或高表達(dá)miR-203患者有更好生存期((P<0.05)。
　　2.肝癌患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)與EZH2、Bmi-1、miR-203、腫瘤分

4、級(jí),門脈癌栓密切相關(guān)(p<0.05),EZH2、Bmi-1及miR-203的表達(dá)及腫瘤分化程度為復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　3.miR-203與EZH2、Bim-1表達(dá)負(fù)相關(guān),EZH2與Bim-1表達(dá)正相關(guān)。
　　【結(jié)論】
　　1.EZH2、Bim-1、miR-203、門脈侵犯、腫瘤大小、分化程度及術(shù)前治療與肝癌肝移植術(shù)后生存率密切相關(guān)。
　　2.影響肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素有EZH2、Bim-1、miR-20

5、3、分化程度及門靜脈癌栓。EZH2、Bim-1、mir-203、分化程度是肝癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素,其表達(dá)可以作為評(píng)估移植預(yù)后的參考評(píng)判指標(biāo)。
　　3.miR-203表達(dá)與EZH2、Bim-1表達(dá)密切相關(guān),共同參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移。
　　第二部分EZH2、Bmi-1通過miR-203協(xié)同調(diào)控對(duì)肝癌細(xì)胞株Hep3B增殖及侵襲作用的研究
　　【目的】
　　分別下調(diào)Hep3B細(xì)胞中EZH2基因表達(dá),和使m

6、ir-203基因過表達(dá),檢測兩種條件下,EZH2、Bim-1及miR-203的表達(dá)情況和Hep3B細(xì)胞增殖、凋亡和腫瘤侵襲情況,探討EZH2、Bim-1及miR-203對(duì)Hep3B細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的協(xié)調(diào)調(diào)控作用,為肝癌肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)防與治療提供新的靶向治療位點(diǎn)。
　　【方法】
　　1.人四系HCC細(xì)胞及正常肝細(xì)胞MicroRNA203基因以及EZH2、bmi-1表達(dá)檢測
　　2.構(gòu)建靶向EZH2基因的shR

7、NA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至人Hep3B細(xì)胞中,采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測EZH2、Bim-1mRNA及蛋白的表達(dá)情況,采用RT-PCR檢測miR-203的表達(dá)情況;利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后Hep3B細(xì)胞增殖和凋亡情況,transwell檢測腫瘤侵襲情況。
　　3.過表達(dá)mir-203基因質(zhì)粒構(gòu)建并轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)hep3B細(xì)胞株;qRTPCR檢測miR-203,EZH2,Bmi-1等3個(gè)基因表達(dá),WB檢測

8、EZH2以及bmi-1蛋白,及穩(wěn)轉(zhuǎn)后細(xì)胞株的凋亡和增值能力檢測,transwell檢測腫瘤侵襲情況
　　【結(jié)果】
　　1.EZH2,Bmi-1,Mir-203的表達(dá)在HCC細(xì)胞與正常肝細(xì)胞均有表達(dá),EZH2、Bmi-1四系HCC細(xì)胞(PLC,Huh7,Hep3B,HepG2)中均較在正常細(xì)胞LO2中的表達(dá)高(p值均<0.05);Mir-203在四系的HCC細(xì)胞的表達(dá)均較正常肝細(xì)胞的表達(dá)程度低(p值均<0.05)。
　　

9、2.靶向EZH2基因的shRNA質(zhì)粒成功抑制了Hep3B細(xì)胞EZH2基因的表達(dá)。細(xì)胞的生長受到明顯抑制(P<0.001),以晚期明顯。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01。MiR-203水平明顯上調(diào)(p<0.05),Bmi-1水平明顯下調(diào)(p<0.05)。
　　3.轉(zhuǎn)染miR-203基因使之在Hep3B細(xì)胞中過表達(dá),Bim-1蛋白水平顯著下調(diào)(p<0.05),EZH2蛋白水平及mRNA水平也有下調(diào)(p<0.05),侵襲能力以及增殖水平下

10、調(diào),凋亡水平上升。
　　【結(jié)論】
　　(1)下調(diào)EZH2的表達(dá)后,Bim-1蛋白及mRNA水平顯著下調(diào),MiR-203水平上調(diào),侵襲能力以及增殖水平下調(diào),凋亡水平上升。
　　(2)miR-203基因過表達(dá)時(shí),Bim-1、EZH2蛋白水平及mRNA水平下調(diào),侵襲能力以及增殖水平下調(diào),凋亡水平上升。
　　(3)EZH2、Bmi-1可能通過miR-203構(gòu)成一個(gè)表觀沉默機(jī)制完整的調(diào)節(jié)軸,協(xié)同調(diào)控Hep3B細(xì)胞的增殖及侵