BMI-1在腫瘤發(fā)生中的機制研究.pdf

1、第一部分：實時熒光定量RT-PCR檢測BMI-1mRNA在白血病細胞中的表達 目的：建立SYBRGreenⅠ實時定量RT-PCR方法檢測白血病細胞中BMI-1mRNA。方法：在TRIzol提取總RNA后，將mRNA逆轉錄成cDNA，再用SYBRGreenⅠ實時定量PCR方法檢測BMI-1mRNA在白血病細胞系，擴增產(chǎn)物的特異性通過熔解曲線和凝膠電泳雙重確認。結果：(1)BMI-1mRNA在白血病細胞系均存在表達，其中U937表達

2、最高，而HL-60表達最低。(2)與健康體檢者的外周血白細胞相比，BMI-1mRNA在白血病細胞中的表達顯著升高(P＜0.01)。結論：(1)SYBRGreenⅠ實時定量RT-PCR是一種快速有效、靈敏度高、特異性良好的定量檢測BMI-1mRNA的方法。(2)BMI-1參與白血病的發(fā)生，可能是一種新的腫瘤分子標記物。 第二部分：BMI-1-pEGFP真核表達載體的構建及其在Hela細胞中的表達 目的：構建并鑒定真核表達載

3、體BMI-1-pEGFP，觀察其在人類宮頸癌細胞系Hela中的過表達以及對細胞周期和可能的下游基因表達的影響。方法：將BMI-1逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)產(chǎn)物克隆入真核表達載體pEGFP-N1，經(jīng)酶切、PCR鑒定及測序分析，構建BMI-1-pEGFP真核表達載體；采用脂質(zhì)體轉染法，將質(zhì)粒BMI-1-pEGFPDNA轉染Hela細胞，熒光顯微鏡觀察其表達。結果：(1)重組真核表達載體BMI-1-pEGFP已成功載入BMI-1的全

4、長編碼基因(除終止密碼子外)，序列測定的結果與預期設計完全一致。(2)熒光顯微鏡下可見在轉染BMI-1-pEGFP融合基因的Hela細胞中存在熒光分布；實時熒光定量RT-PCR檢測BMI-1mRNA表達平均升高約1260倍，WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)存在外源性的融合蛋白BMI-1-EGFP的表達。(3)在Hela細胞中過表達BMI-1顯著下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達，分別為對照組的9.2％、10.

5、9％和69.7％(P＜0.01)，而hTERT和HOXB4兩者mRNA的表達量無明顯變化。(4)BMI-1-pEGFP轉染Hela細胞后，G1期細胞由65.68％減少至50.53％，S期細胞由27.17％增加到29.59％，G2/M期細胞數(shù)目變化不明顯。結論：(1)成功構建了真核表達質(zhì)粒BMI-1-pEGFP。(2)BMI-1-pEGFP轉染Hela細胞后過表達BMI-1顯著下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表

6、達，而hTERT和HOXB4兩者mRNA的表達量無顯著改變；同時G1期細胞減少，S期細胞增加，這可能是BMI-1參與宮頸癌發(fā)生的機制之一。 第三部分：BMI-1shRNA真核表達載體的構建、鑒定及其在Hela細胞中的表達 目的：針對BMI-1基因的不同部位構建4種不同的BMI-1shRNA真核表達載體BMI-1shRNA1、2、3、4，轉染人類宮頸癌細胞系Hela篩選有效序列，并進一步應用G418抗性篩選穩(wěn)定轉染細胞株。

7、方法：用DNA重組技術將針對人BMI-1基因的不同部位所設計的4對shRNA序列克隆到真核表達質(zhì)粒psiRNA-hHlneo中。實時熒光定量RT-PCR方法檢測轉染前后Hela細胞中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9、HoxB4和HOXC13mRNA的表達變化，WesternBlot檢測BMI-1蛋白的表達變化，PI染色FACS檢測轉染前后Hela細胞的細胞周期變化。結果：(1)4種shRNA表達載體BMI-1shRN

8、A1、2、3、4經(jīng)測序鑒定證明插入正確。(2)在Hela細胞中轉染BMI-1shRNA1、2、3、4，實時熒光定量RT-PCR檢測BMI-1mRNA表達發(fā)現(xiàn)只有BMI-1shRNA2和4能顯著下調(diào)BMI-1mRNA的表達，分別為對照組的40.1％、32.6％，抑制率分別為59.9％和67.4％，BMI-1蛋白的表達量明顯下降。(3)穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的Hela細胞中P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的

9、表達分別上調(diào)9-12倍、13-14倍、7-8倍，而hTERT和HOXB4兩者的mRNA表達量無變化變化。(4)BMI-1shRNA2和4轉染Hela細胞后，G1期細胞增加，S期細胞減少。結論：(1)成功構建了真核表達載體BMI-1shRNA1、2、3、4。(2)BMI-1shRNA2和4能有效地抑制BMI-1在Hela細胞中的表達；而在Hela細胞下調(diào)BMI-1能顯著上調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13的表達，同時導致G1期細

10、胞增加，S期細胞減少。 第四部分：過表達BMI-1對MDA-MB-231、MCF-7、K562、Jurkat的影響 目的：將第二部分構建成功的真核表達載體BMI-1-pEGFP分別轉染人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7、人類白血病細胞系K562和Jurkat，分別觀察BMI-1的過表達以及對可能的下游基因表達的影響。方法：采用脂質(zhì)體轉染法，將質(zhì)粒BMI-1-pEGFPDNA轉染MDA-MB-231、MCF-

11、7、K562和Jurkat細胞并篩選穩(wěn)定轉染細胞株，WesternBlot檢測BMI-1蛋白的表達變化，實時熒光定量RT-PCR檢測其中BMI-1、P16INK4a、hTERT、HOXA9和HOXC13mRNA的表達變化。結果：(1)熒光顯微鏡下可見在轉染BMI-1-EGFP融合基因的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞中存在熒光分布，BMI-1mRNA的表達水平分別平均升高78.63、65.72、43.25和3

12、6.78倍。(2)在MDA-MB-231和MCF-7細胞中過表達BMI-1分別平均上調(diào)hTERTmRNA的表達36.53倍和27.33倍，分別下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達為各自對照組的62.8％和57.4％、65.7％和63.5％、73.5％和69.3％，而MCF-7細胞中不表達HOXB4mRNA。(3)在K562和Jurkat細胞中過表達BMI-1能顯著下調(diào)HOXC13mRNA的表達，分別為各自對照

13、組的64.8％和67.2％，而HOXB4mRNA的表達量無明顯變化。結論：(1)真核表達質(zhì)粒BMI-1-pEGFP轉染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞能表達融合蛋白BMI-1-EGFP。(2)在MDA-MB-231和MCF-7細胞中過表達BMI-1顯著上調(diào)hTERTmRNA的表達，下調(diào)P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達。(3)在K562和Jurkat細胞中過表達BMI-1顯著下調(diào)HO

14、XC13mRNA的表達，HOXB4mRNA的表達量無顯著改變。 第五部分：BMI-1沉默對MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞的抑制作用 目的：將第三部分構建成功并鑒定的真核表達載體BMI-1shRNA2、4分別轉染人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7、人類白血病細胞系K562和Jurkat，分別觀察BMI-1在MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞中的下調(diào)以及對

15、可能的下游基因表達的影響。方法：采用脂質(zhì)體轉染法，將質(zhì)粒BMI-1shRNA2、4DNA轉染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞并篩選穩(wěn)定轉染細胞株，WesternBlot檢測BMI-1蛋白的表達，實時熒光定量RT-PCR檢測表達變化。結果：(1)穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞中BMI-1mRNA的表達水平分別降低為各自對照組的34.2％和28.6

16、％、36.5％和32.1％、42.5％和35.4％、40.8％和34.6％，BMI-1蛋白表達分別降低為各自對照組的40.9％和35.6％、42.7％和38.5％、45.6％和37.6％、43.4％和36.8％。(2)穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231和MCF-7細胞中hTERTmRNA的表達分別降低為各自對照組的65.2％和59.6％、62.7％和58.4％；P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA

17、的表達水平分別升高7-9倍、10-12倍、6-8倍，而MCF-7細胞中不表達HOXB4mRNA，后者在MDA-MB-231細胞中的表達量無明顯變化。(3)K562和Jurkat細胞不表達P16INK4a和HOXA9mRNA，穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的K562和Jurkat細胞中HOXC13mRNA的表達水平分別升高8-10倍、9-11倍，而HOXB4mRNA的表達量無明顯改變。結論：(1)真核表達質(zhì)粒BMI-1shRNA2、4

18、轉染MDA-MB-231、MCF-7、K562和Jurkat細胞能顯著下調(diào)BMI-1mRNA和蛋白質(zhì)的表達。(2)穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的MDA-MB-231和MCF-7細胞中hTERTmRNA的表達顯著下調(diào)，而P16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA的表達則顯著上調(diào)。(3)穩(wěn)定轉染BMI-1shRNA2、4的K562和Jurkat細胞中HOXC13mRNA的表達顯著上調(diào)，而HOXB4mRNA的表達量無顯著改變