診斷超聲對HEK-293細胞凋亡的影響及其機制.pdf

1、目的：探討診斷超聲照射對體外培養(yǎng)的HEK-293 細胞凋亡的影響及其機制，以進一步明確超聲照射對胚胎細胞的影響作用，比較照射劑量的不同所產(chǎn)生的不同的生物學效應。 方法：采用HEK-293細胞，應用傳代培養(yǎng)技術，完成HEK-293細胞的體外培養(yǎng)。進行超聲劑量分組，建構照射模型。主要分成四個劑量梯度(分別為0min、10min、20min、30min，均為產(chǎn)科條件)，每個劑量梯度設三個平行瓶，重復三次。對處理后的細胞進行Hoechs

2、t33258凋亡染色，觀察細胞形態(tài)結構的變化；對其進行PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期分布；對處理后的細胞進行Annexin V-FITC/PI細胞凋亡染色，流式細胞儀檢測并行凋亡細胞計數(shù)。處理后的細胞進行RT-PCR對Caspase-3凋亡關鍵酶的RNA水平進行測定；活化的Caspase-3蛋白表達水平進行免疫細胞化學的檢測。 結果：HEK-293 細胞體外培養(yǎng)成功，細胞狀態(tài)良好，貼壁生長。Hoechst33258染色顯示空白

3、組細胞經(jīng)超聲假照后，細胞核大小較一致，核膜完整，未見異形核，超聲處理10min組的細胞，對比空白組部分細胞核形態(tài)出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象，但細胞核的結構未出現(xiàn)異常，超聲處理20min組，細胞核大小不均，一部分細胞核脹大，染色質(zhì)邊集，一部分細胞核縮小濃染，超聲處理30min組，細胞形態(tài)變化最大，可見異形核的出現(xiàn)，部分核內(nèi)染色質(zhì)濃染邊集成小團塊狀，個別核膜破裂染色質(zhì)疏松分布于胞質(zhì)中；隨著超聲照射劑量的加大可以使HEK-293 細胞的周期發(fā)生改變，

4、超聲處理20min組S期增加(P<0.05)，30min組G0/G1期增加(P<0.05)，其中G2/M期減少、S 期增加有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；Annexin V-FITC/PI 雙染色顯示，隨著超聲照射劑量的增加，流式計數(shù)的細胞凋亡率增加，20min組具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，30min組具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；超聲照射對凋亡關鍵蛋白酶Caspase-3 的 mRNA 轉錄水平未見明顯影響，對其蛋白表達水

5、平可見影響，超聲照射20min 后，胞漿里逐漸出現(xiàn)了凋亡蛋白酶 Caspase-3的表達，并隨著照射劑量的增加，Caspase-3的表達水平增加。 結論：大劑量的超聲照射可對體外培養(yǎng)的 HEK-293 細胞產(chǎn)生凋亡及相關的影響。隨著超聲照射的時間達到或超過 20min，部分細胞會逐步出現(xiàn)核形態(tài)的改變，如染色質(zhì)邊集，異形核的出現(xiàn)，甚至核膜破裂；可使細胞周期分布改變，G0/G1期和S期阻滯，進入 G2/M 期的細胞減少；可使細胞凋亡