楊梅花色苷對胰島細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制探討.pdf

1、本研究屬國家自然科學基金資助項目，旨在探討楊梅果實提取物對胰島細胞氧化應激損傷的保護效應及其分子機制，探索其在胰島移植領域的可能應用前景，為楊梅花色苷成為一種潛在的胰島保護劑奠定相應理論基礎。我們同時還初步探討了自噬在胰島體外氧化應激損傷及體內移植后的發(fā)生。
　　 研究方法：
　　 1、楊梅花色苷對胰島細胞的保護效應
　　 （1）楊梅果實提取物的制備、鑒定及抗氧化活性的測定
　　 楊梅果實用含鹽酸的甲醇溶

2、液浸提，用旋轉蒸發(fā)儀進行濃縮。提取物中總酚類化合物的含量采用Folin-Ciocalteau比色法測定，總黃酮類化合物的含量采用比色法測定，花色苷含量采用pH示差分光光度法測定。
　　 采用HPLC對楊梅花色苷組成進行鑒定及含量測定；采用DPPH方法測定楊梅花色苷自由基清除活性。MTT法觀察其對胰島細胞系INS-1的細胞毒性。
　　 （2）楊梅花色苷對H2O2誘導的胰島細胞凋亡的影響
　　 采用MTT法觀察花色苷

3、預處理對胰島細胞系的保護效應，用臺盼藍據(jù)染實驗及LDH釋放試驗進一步驗證。
　　 采用ROS特異熒光探針DCF-DA檢測胞內ROS的產生。Hoechst33258染色觀察細胞凋亡情況，流式細胞術觀察細胞凋亡及死亡變化；提取細胞蛋白，westernblot觀察相關凋亡蛋白caspase-3,-9及Bcl-2的表達。
　　 （3）楊梅花色苷對H2O2誘導的胰島細胞自噬的影響
　　 將mRFP-GFP-LC3質粒轉染I

4、NS-1細胞后，給予H2O2刺激，熒光顯微鏡下觀察細胞內LC3的點聚情況。電鏡觀察H2O2刺激后細胞內自噬泡的形成。Westernblot觀察H2O2刺激不同時間后，LC3和BECN1的表達變化。
　　 采用BECN1 siRNA下調BECN1表達，western blot觀察自噬相關蛋白LC3和凋亡相關蛋白caspase-9的變化，并進一步用MTT法及LDH釋放試驗驗證。
　　 （4）楊梅花色苷預處理在腎包膜下移植后早

5、期對細胞移植物的影響
　　 將INS-1細胞移植入糖尿病受體小鼠腎包膜下，72h后取出移植物，部分用4％多聚甲醛固定，部分用戊二醛固定以備做電鏡，部分OCT包埋劑包埋后液氮速凍，-80℃保存以備冰凍切片。石蠟切片行H&E、insulin和BECN-1免疫組化染色及TUNEL染色。冰凍切片行LC3免疫熒光染色，電鏡觀察移植物超微結構變化。
　　 2.花色苷對胰島細胞系保護機制的探討
　　 采用RT-PCR及定量PC

6、R檢測花色苷處理后INS-1細胞HO-1 mRNA的表達。western blot方法檢測HO-1的蛋白表達水平。
　　 分離小鼠原代胰島，給予花色苷處理，RT-PCR和定量PCR觀察HO-1的表達。將處理后的胰島冰凍切片并進行Insulin和HO-1免疫熒光雙染驗證HO-1的表達。
　　 用HO-1 siRNA下調HO-1的表達后，給予luM花色苷24h,western blot檢測HO-1表達變化。MTT法檢測HO-

7、1下調后花色苷對胰島細胞的保護效應。Westernblot檢測caspase-3,-9及LC3的表達。
　　 研究結果：
　　 1.楊梅花色苷對胰島細胞的保護效應
　　 （1）楊梅花色苷中最主要的成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷
　　 楊梅果實提取物中花色苷為總黃酮類化合物中主要組成部分。對楊梅花色苷進行HPLC分析，發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-葡萄糖苷為楊梅花色苷最主要成分，比例在90％以上。DPPH法檢測結果提示楊

8、梅果實提取物具有較強的氧自由基清除活性。楊梅花色苷濃度在5uM以內時，對INS-1細胞的活性無明顯影響。
　　 （2）楊梅花色苷減少了H2O2誘導的胰島細胞的凋亡和壞死
　　 H2O2刺激導致細胞活性下降，并呈濃度和時間依賴性，MTT結果花色苷預處理能夠顯著提高細胞活性，降低H2O2對其的損傷。臺盼藍據(jù)染實驗和LDH釋放實驗進一步證明luM花色苷預處理24h可明顯保護胰島細胞系抵抗H2O2損傷。PI單染流式檢測顯示花色苷

9、預處理明顯減少了H2O2誘導的細胞壞死。
　　 熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測提示花色苷預處理減少了H2O2誘導的胞內過量ROS的產生。流式細胞儀檢測結果提示花色苷預處理減少了H2O2誘導的細胞凋亡及壞死。Western blot顯示花色苷預處理減少了H2O2誘導的caspase-3,-9的剪切體的產生，并上調了Bcl-2的表達，進一步支持花色苷可減少H2O2誘導的凋亡。
　　 （3）楊梅花色苷減少了H2O2誘導的胰島細胞的

10、自噬
　　 mRFP-GFP-LC3質粒轉染INS-1細胞，給予H2O2刺激后，熒光顯微鏡觀察到胞漿內出現(xiàn)LC3的點聚。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)在H2O2處理組細胞胞漿內出現(xiàn)較多明顯的空泡，有腫脹的線粒體及含胞內容物的自噬泡。Western blot結果提示lmMH2O2作用0.5,1,2及4h后，LC3B及BECN1的表達逐漸上調，且在2h處表達量最高。
　　 采用BECN-1 siRNA轉染INS-1細胞下調BECN-1的表達，

11、降低了H2O2誘導的自噬的發(fā)生。Western blot結果顯示BECNl siRNA轉染后H2O2誘導的caspase-9剪切體表達下降。MTT實驗及LDH釋放實驗提示抑制自噬減少了H2O2刺激導致的細胞的損傷。
　　 AO及MDC染色結果提示花色苷預處理減少了H2O2刺激導致的胞內自噬泡及酸性溶酶體的產生。Western blot結果顯示H2O2刺激2h后LC3II表達明顯增加，LC3II/LC3I值增大，而花色苷預處理則降

12、低了LC3II的表達和LC3II/LC3I的比例。
　　 （4）楊梅花色苷預處理對移植后早期細胞移植物的影響
　　 INS-1細胞移植入腎包膜下72h后，取出移植物，insulin免疫組化染色證實為胰島細胞系。TUNEL染色顯示部分細胞移植物在72h時出現(xiàn)凋亡。免疫組化染色提示BECN1強陽性，LC3免疫熒光提示移植物胞漿內出現(xiàn)LC3的點聚，電鏡檢查顯示移植物胞漿內出現(xiàn)含胞內容物的自噬泡，支持自噬的發(fā)生。
　　

13、2.楊梅花色苷保護胰島的機制探討
　　 （1）楊梅花色苷濃度及時間依賴型的上調HO-1的表達
　　 定量PCR及western blot結果提示花色苷濃度及時間依賴的上調了INS-1細胞HO-1的表達。在小鼠胰島細胞系beta-TC-6，花色苷同樣可濃度依賴型的上調HO-1的表達。
　　 RT-PCR及定量PCR結果顯示花色苷孵育也明顯上調了原代胰島HO-1基因表達水平。胰島冰凍切片Insulin和HO-1免疫熒

14、光雙染提示花色苷處理組胰島細胞HO-1的表達水平高于未處理組。
　　 （2）HO-1的上調表達參與了花色苷的保護效應
　　 MTT結果顯示HO-1 siRNA轉染組細胞，H2O2刺激后，活性明顯下降，并且降低了花色苷對INS-1細胞的保護效應。Western blot結果顯示，與單純H2O2處理組相比，HO-1 siRNA轉染組細胞caspase-3,-9前體表達水平下降，cleavedcaspase-9表達增加，同時L

15、C3II表達及LC3II/LC3I值增加。
　　 給予空載體與pLNCX2-HO1轉染組INS-1細胞H2O2刺激，MTT結果顯示HO-1過表達細胞其活性較對照組高。LC3免疫熒光染色顯示HO-1過表達細胞胞內LC3點聚程度低于對照組。
　　 （3）花色苷通過ERK1/2及PI3K/Akt通路介導HO-1的上調表達Western blot結果提示花色苷濃度及時間依賴性的上調pERK1/2及pAkt的表達，而JNK通路則未

16、被激活。PD98059及LY294002預處理抑制了花色苷對HO-1蛋白的上調表達。MTT結果顯示與單一花色苷處理組相比，PD98059及LY294002預處理組細胞活性下降，降低了花色苷對胰島細胞的保護效應。
　　 （4）花色苷誘導轉錄因子Nrf2向細胞核內轉移
　　 激光共聚焦掃描結果表明，與未處理組相比，花色苷誘導了部分Nrf2向細胞核內的轉移。提取細胞核蛋白，western blot結果提示luM的花色苷誘導了N

17、rf2在細胞核內的表達。
　　 小結：
　　 1.楊梅花色苷中最主要成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，其比例占至90％以上。楊梅花色苷具有較強的氧自由基清除能力；其濃度在5uM以內時，對胰島細胞系INS-1細胞無明顯毒性。
　　 2.花色苷預處理可以明顯降低H2O2刺激導致的細胞內過量ROS的產生，進而減少氧化應激損傷所致的細胞凋亡和壞死。
　　 3.H2O2刺激除可導致細胞凋亡和壞死外，還可引起細胞發(fā)生自噬

18、，且發(fā)生的自噬促進細胞死亡。花色苷預處理可以減少H2O2誘導細胞自噬的發(fā)生。
　　 4.細胞移植入腎包膜下早期，在各類刺激下可發(fā)生凋亡和自噬。在移植前予以花色苷預處理，可降低細胞移植后凋亡和自噬的發(fā)生程度。
　　 5.花色苷可上調胰島細胞（系）HO-1的表達，且存在明顯的時間-效應關系和劑量-效應關系。HO-1的上調表達可減少H2O2誘導的自噬和凋亡，參與了花色苷對胰島細胞的保護作用。花色苷通過ERK1/2及PI3K/A