補(bǔ)腎壯骨法對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡衣基質(zhì)代謝的影響.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變，軟骨破壞是其主要的病理特點(diǎn)。骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)給家庭和社會(huì)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，NSAIDs(非甾類抗炎藥)類藥物是用于治療OA最常用的處方藥，雖然能夠緩解患者的疼痛，但并不能抑制軟骨破壞及延緩OA進(jìn)程。中醫(yī)藥治療OA具有療效好、副作用小的優(yōu)勢(shì)。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨法治療OA療效顯著，總有效率為90％，能夠改善患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，改善關(guān)節(jié)功

2、能；實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨法能夠改善OA動(dòng)物模型關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，抑制軟骨細(xì)胞數(shù)量減少。因此，深入研究中醫(yī)藥抑制軟骨破壞發(fā)揮軟骨保護(hù)作用及其可能的分子機(jī)制是非常必要的。
　　本課題在補(bǔ)腎壯骨法治療OA的學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下，以國家自然基金為依托，以體外培養(yǎng)的人OA軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象，采用中藥血清藥理學(xué)，借助現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究補(bǔ)腎壯骨法對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及基質(zhì)代謝的影響。
　　1實(shí)驗(yàn)研究一：人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞系建立與鑒定
　　目

3、的：建立人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有限細(xì)胞系，觀察其生長和形態(tài)特性，為進(jìn)一步開展OA軟骨細(xì)胞分解代解及藥物發(fā)揮軟骨保護(hù)作用相關(guān)領(lǐng)域的細(xì)胞分子生物學(xué)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　方法：在北醫(yī)三院骨關(guān)節(jié)矯形中心協(xié)助下，取需作全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的OA患者10例(女性，65-85歲)，采用酶消化原代培養(yǎng)法建立人OA軟骨細(xì)胞系。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖特性；采用甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原免疫組化鑒定細(xì)胞來源；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長、形態(tài)變化。<

4、br>　　結(jié)果：成功建立了人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有限細(xì)胞系，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，生物學(xué)性狀穩(wěn)定；甲苯胺藍(lán)與Ⅱ型膠原免疫組化證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為來自中胚層的軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用酶消化原代培養(yǎng)法，成功建立了生物學(xué)性狀穩(wěn)定的OA軟骨細(xì)胞有限細(xì)胞系，經(jīng)鑒定為中胚層來源的軟骨細(xì)胞，為研究OA發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)細(xì)胞基質(zhì)代謝作用提供了較好體外模型。
　　2實(shí)驗(yàn)研究二：人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡研究
　　目的：以正常人

5、膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為對(duì)照，觀察體外培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡特征，研究OA軟骨細(xì)胞的基本生物學(xué)特性。
　　方法：在北醫(yī)三院骨關(guān)節(jié)矯形中心協(xié)助下，取因外傷急性截肢患者的軟骨組織以及全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)OA患者的軟骨組織，采用酶消化培養(yǎng)法培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞的增殖特性；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞與正常軟骨細(xì)胞周期特點(diǎn)與凋亡率的不同。
　　結(jié)果：OA軟骨細(xì)胞較正常軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為過度凋

6、亡(P<0.01)，S期細(xì)胞比例降低(P<0.05)，且細(xì)胞增殖明顯緩慢(P<0.01)。
　　結(jié)論：在OA發(fā)病過程中，OA軟骨細(xì)胞過度凋亡及增殖緩慢可能是加速OA軟骨破壞的重要因素。
　　3實(shí)驗(yàn)研究三：人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)狀況
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，觀察OA軟骨細(xì)胞上清液中IL-1β(interleukin-1β)含量及軟骨細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)狀況，探討IL-1β在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。<

7、br>　　方法：采用ELISA法比較OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：OA軟骨細(xì)胞較正常軟骨細(xì)胞上清液中IL-1β含量增多(P<0.05)，且IL-1β蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。
　　結(jié)論：細(xì)胞因子IL-1β在OA軟骨破壞中發(fā)揮重要作用。IL-1β通過對(duì)MMPs(金屬基質(zhì)蛋白酶)的異常調(diào)控，促進(jìn)軟骨細(xì)胞分解

8、代謝：同時(shí)IL-1β可能通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡、發(fā)揮促炎作用，促進(jìn)軟骨破壞。
　　4實(shí)驗(yàn)研究四：人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶蛋白表達(dá)狀況
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，觀察OA軟骨細(xì)胞MMPs(金屬基質(zhì)蛋白酶)蛋白表達(dá)狀況，探討MMPs在OA軟骨破壞中的作用。
　　方法：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞MMP-1、3、13蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：OA軟骨細(xì)胞MMP-1、MMP-

9、3、MMP-13蛋白表達(dá)較正常軟骨細(xì)胞明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　結(jié)論：金屬基質(zhì)蛋白酶在OA發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，加速細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝，導(dǎo)致OA軟骨破壞的發(fā)生。
　　5實(shí)驗(yàn)研究五：牛膝健步顆粒對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，探討牛膝健步顆粒對(duì)體外培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　方法：將軟骨細(xì)胞分成正常軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組、OA軟骨

10、細(xì)胞組+對(duì)照血清組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清小劑量組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清中劑量組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清大劑量組，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細(xì)胞24h后，應(yīng)用CCK-8法比較各組細(xì)胞增殖情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：牛膝健步顆?？擅黠@促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖，抑制OA軟骨細(xì)胞早期凋亡(P<0.01)。
　　結(jié)論：牛膝健步顆粒抑制OA軟骨細(xì)胞過度凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這可能是抑制OA軟骨破壞的重要機(jī)制之一。

11、r>　　6實(shí)驗(yàn)研究六：牛膝健步顆粒對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，探討牛膝健步顆粒對(duì)體外培養(yǎng)OA軟骨維細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響，研究牛膝健步顆粒是否具有抑制OA軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β的作用。
　　方法：將軟骨細(xì)胞分成正常軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組+對(duì)照血清組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清小劑量組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清中劑量組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清大劑量

12、組，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細(xì)胞48h后，采用ELISA法比較各組細(xì)胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：牛膝健步顆粒可明顯抑制細(xì)胞上清液中IL-1β含量(P<0.01)，可明顯抑制OA軟骨細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)(P<0.01)。
　　結(jié)論：牛膝健步顆粒抑制軟骨細(xì)胞分泌IL-1β，發(fā)揮抗炎作用；同時(shí)抑制IL-1β對(duì)MMPs的異常調(diào)控，抑制MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解

13、，從而抑制OA軟骨破壞。
　　7實(shí)驗(yàn)研究七：牛膝健步顆粒對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶蛋白表達(dá)的影響
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，觀察牛膝健步顆粒含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)OA軟骨維細(xì)胞MMPs表達(dá)的影響，探討牛膝健步顆粒是否具有抑制OA軟骨細(xì)胞MMPs的作用。
　　方法：將軟骨細(xì)胞分成正常軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組+對(duì)照血清組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清小劑量組、OA軟骨細(xì)胞組+含藥血清中劑量組、OA軟

14、骨細(xì)胞組+含藥血清大劑量組，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細(xì)胞48h后，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞MMP-1、3、13蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：牛膝健步顆?？擅黠@抑制MMP-1、3、13的蛋白表達(dá)(P<0.01)。
　　結(jié)論：牛膝健步顆粒抑制OA軟骨細(xì)胞MMPs的表達(dá)，從而抑制MMPs對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，使細(xì)胞的合成代謝與分解代謝達(dá)到平衡狀態(tài)，抑制OA軟骨破壞。
　　8實(shí)驗(yàn)研究八：淫羊藿苷對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及

15、凋亡的影響
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，探討淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　方法：將軟骨細(xì)胞分成正常軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組+淫羊藿苷組，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細(xì)胞48h后，應(yīng)用CCK-8法比較各組細(xì)胞增殖情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：淫羊藿苷可明顯促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖(P<0.01)，抑制OA軟骨細(xì)胞早期凋亡(P<0.01)。
　　結(jié)論：淫羊藿苷抑制

16、OA軟骨細(xì)胞過度凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這可能是抑制OA軟骨破壞的重要機(jī)制之一。
　　9實(shí)驗(yàn)研究九：淫羊藿苷對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞IL-1β及金屬基質(zhì)蛋白酶表達(dá)的影響
　　目的：以正常軟骨細(xì)胞為對(duì)照，研究淫羊藿苷對(duì)體外培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1β及金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)表達(dá)的影響，探討淫羊藿：苷是否具有抑制軟骨細(xì)胞分解代謝，從而抑制軟骨破壞的作用。
　　方法：將軟骨細(xì)胞分成正常軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)胞組、OA軟骨細(xì)

17、胞組+淫羊藿苷組，根據(jù)分組情況培養(yǎng)細(xì)胞48h后，采用ELISA法比較各組細(xì)胞上清液中IL-1β的含量；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、MMP-1、3、13蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：淫羊藿苷能夠抑制細(xì)胞上清液中IL-1β含量(P<0.05)，且明顯抑制IL-1β及MMP-1、3、13的蛋白表達(dá)(P<0.01)。
　　結(jié)論：淫羊藿苷抑制軟骨細(xì)胞分泌IL-1β，發(fā)揮抗炎作用；同時(shí)抑制IL-1β對(duì)MMPs的異