京尼平苷對兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過研究京尼平苷對體外培養(yǎng)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖、Ⅱ型膠原、周期蛋白2(CDC2)表達(dá)和軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α含量的影響,探討京尼平苷對 OA 軟骨退變的保護(hù)作用及可能的機(jī)制,為臨床應(yīng)用中藥梔子治療OA提供理論指導(dǎo)。
　　方法：采用改良Hulth法制備兔膝OA模型(前交叉韌帶+內(nèi)側(cè)副韌帶切斷、內(nèi)側(cè)半月板切除),15只日本大耳白兔隨機(jī)分為：A模型組12只；B正常組3只,通過形態(tài)學(xué)、影像學(xué)、生化

2、指標(biāo)鑒定模型,提取正常組、模型組軟骨細(xì)胞,原代培養(yǎng)、傳代。光鏡觀察原代、二代、四代細(xì)胞形態(tài),免疫熒光和 ELISA 檢測模型組軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α含量鑒定兔膝OA軟骨細(xì)胞。培養(yǎng)兔膝OA軟骨細(xì)胞應(yīng)用不同濃度京尼平苷(20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml)干預(yù)：噻唑藍(lán)染色(MTT)法檢測軟骨細(xì)胞增殖,Western-blot 檢測Ⅱ型膠原及細(xì)胞分裂周期分裂基因2(CDC2)蛋

3、白的表達(dá),PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)；ELISA檢查培養(yǎng)兔膝OA軟骨細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α含量影響。
　　結(jié)果：從形態(tài)學(xué)、影像學(xué)、生化指標(biāo)表明改良Hulth法成功構(gòu)建兔膝OA模型,關(guān)節(jié)液中IL-1含量為正常組77.64±9.37pg/ml；造模4W175.52±18.7 pg/ml；造模8W363.42±54.11 pg/ml,關(guān)節(jié)液中TNF-α含量為正常組：49.99±5.28 pg/ml；造模4W143.38

4、±48.34 pg/ml；造模8W280.72±42.24 pg/ml,血清中IL-1含量為正常組10.66 ±1.04 pg/ml；造模4W51.19±4.66 pg/ml；造模8W96.83±9.48 pg/ml,血清中TNF-α含量為正常組15.74±1.05 pg/ml；造模4W25.22±2.43 pg/ml；造模8W46.15±7.04 pg/ml(P<0.05)。原代兔膝OA軟骨細(xì)胞呈多角形,培養(yǎng)72h后基本貼壁,傳代后細(xì)

5、胞生長加快,隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞逐漸出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,呈圓形,多短觸角；免疫熒光檢測模型組軟骨細(xì)胞中有Ⅱ型膠原表達(dá)。ELISA檢測模型組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1、TNF-α含量增高,IL-1含量為正常組6.948±0.48 pg/ml；VS造模組65.47 ±5.52 pg/ml,TNF-α含量為正常組5.13±0.74 pg/ml；VS模型組45.49±3.99 pg/ml (P<0.05)。鑒定兔膝OA軟骨細(xì)胞。隨著給藥濃度的不

6、同(20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml)對兔膝OA軟骨細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用,各組24小時增殖率分別為(3.87 ±5.61)%、(23.48±3.50)%、(11.16±7.048)%、(9.29±3.43)%；48小時增殖率分別為(30.01±1.28)(38.80±.2.65)(44.85±.43)(36.16±3.47)；72小時增殖率分別為(4.91±2.04)(8.29±1.32)(13.84±

7、2.54)(3.23±3.02),(P<0.05)；軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白和基因表達(dá)、CDC2蛋白合成逐漸增高,各組Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)分別為0.448±0.0084；0.391±0.017；0.44±0.019；0.68±0.016；0.484±0.014；各組Ⅱ 型膠原基因的表達(dá)分別為0.383±0.035；0.492±0.047；0.574±0.057；0.618±0.058；0.653±0.057各組CDC2蛋白表達(dá)分別為0.478

8、±0.046；0.579±0.025；0.471±0.037；0.601±0.056；0.8±0.043；(P<0.05)。體外培養(yǎng)兔膝OA軟骨細(xì)胞上清液中IL-1、TNF-α含量逐漸降低,各組IL-1含量分別為：6.948±0.48 pg/ml；65.47±5.52 pg/ml；52.87 ±4.24 pg/ml；43.25±5.55 pg/ml；38.3±1.95 pg/ml；26.82±1.34 pg/ml,各組TNF-α含量分別

9、為：5.13±0.74 pg/ml；45.49±3.99 pg/ml；41.03±2.54 pg/ml；38.12±2.11 pg/ml；32.37±2.42 pg/ml；25.65±2.59 pg/ml。與對照組相比有差異性(P<0.05)。
　　結(jié)論：改良Hulth法造模是制備兔膝OA模型的有效方法,并可以建立體外培養(yǎng)兔膝OA軟骨細(xì)胞體系；京尼平苷對體外培養(yǎng)的兔膝OA軟骨細(xì)胞有一定的增殖作用；并可促進(jìn)CDC2表達(dá),Ⅱ型膠原合