P53調(diào)控的細胞自吞噬在DNA放射損傷反應中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　p53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因之一,也是細胞內(nèi)一個強大的轉(zhuǎn)錄因子,在各種應激包括DNA輻射損傷時,p53可被不同的信號通路激活,并通過增強其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄而引起細胞周期阻滯、凋亡或衰老,保持細胞基因組的完整性并清除損傷細胞,對p53通路的深入研究可為腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供重要信息,本課題圍繞p53在DNA放射損傷反應中的作用及作用機制展開了深入研究。
　　方法：
　　本實驗主要采用細

2、胞平板克隆形成實驗,計算輻射后細胞的存活率;采用胸腺嘧啶雙阻滯法同步化細胞周期于G1/S邊界,再通過流式細胞儀檢測細胞周期,分析p53野生型和缺失型細胞的各周期時相;采用western blotting檢測細胞周期蛋白等的表達;用鹽酸多柔比星處理細胞,再流式分析細胞的各個周期時相。利用慢病毒法構建p53穩(wěn)定敲低及對照細胞系,并經(jīng)western blotting鑒定;利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測p53對p62/SQSTM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;

3、利用Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞儀分析電離輻射誘導的細胞凋亡情況;通過激光共聚焦免疫熒光實驗和western blotting檢測自噬蛋白p62/SQSTM1的表達;利用透射電鏡觀察細胞的自噬泡等方法。
　　結(jié)果：
　　本實驗主要獲得如下結(jié)果:
　　1.p53增強電離輻射后細胞的存活,通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)電離輻射后,HCT116 p53+/+細胞的存活率明顯高于HCT116 p53-/-細胞。<

4、br>　　2.細胞受電離輻射損傷后,經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),HCT116 p53-/-細胞G2/M期阻滯的發(fā)生時間早于HCT116 p53+/+細胞,且G2/M期阻滯的時間明顯長于HCT116 p53+/+細胞。
　　3.TdR雙阻滯法將細胞周期同步化于G1/S期邊界后,流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)HCT116 p53-/-細胞的G2/M期明顯比HCT116 p53+/+細胞時間長。
　　4.1μM Doxorubicin處理細胞后,流

5、式結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT116 p53-/-細胞的S期蓄積明顯比HCT116 p53+/+細胞時間長。
　　5.Western blotting檢測結(jié)果顯示p53穩(wěn)定敲低的A549細胞系構建成功;經(jīng)熒光素酶報告基因檢測顯示,4Gy照射可以強烈激活p62基因啟動的轉(zhuǎn)錄活性,在照射后2h時,其轉(zhuǎn)錄增加了一倍。此外,在p53+/+細胞中,4h之后p62的轉(zhuǎn)錄會緩慢升高,在24h時下降,而在p53-/-細胞中,在4h經(jīng)歷短暫的下降之后,隨后迅速升

6、高,直到24h還沒有下降的趨勢。
　　6.對各種處理組合之后的不同時間點的細胞進行流式分析,發(fā)現(xiàn)正常對照細胞在照射8h左右發(fā)生G2/M阻滯,而p53敲低細胞則在4h左右發(fā)生G2/M阻滯,當這兩種細胞在血清饑餓之后再進行照射時,G2/M期的阻滯明顯向后推遲,并且兩種細胞阻滯發(fā)生時間的差異也在縮小。
　　7.流式檢測細胞凋亡結(jié)果顯示,敲低p53的細胞凋亡率明顯低于p53正常細胞,血清饑餓組的細胞凋亡率明顯低于對照細胞,而3-MA

7、處理組的細胞凋亡率最高。
　　結(jié)論：
　　1,p53增強電離輻射后細胞的存活。
　　2,細胞受電離輻射損傷后,p53可能對G2/M期細胞檢查點的激活有抑制作用,且p53可能在G2/M期細胞轉(zhuǎn)換或M期細胞的退出中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　3,p53在γ射線引起的DNA損傷反應中,主要起到抑制自吞噬的作用,并且這種抑制作用很可能是通過抑制p62蛋白的轉(zhuǎn)錄激活實現(xiàn)的。
　　4,促進自吞噬可以促進電離輻射之后細胞的存