FATS調(diào)控p53蛋白表達的分子機制.pdf

1、目的:
　　通過分子和細胞生物學手段研究新的脆性位點基因FATS調(diào)控p53表達的分子機制，包括FATS與p53蛋白之間的相互作用、DNA損傷信號轉(zhuǎn)導中FATS對p53蛋白的共價修飾、轉(zhuǎn)錄活性及蛋白穩(wěn)定性的影響，進一步確定FATS的抑癌基因性質(zhì)，揭示FATS基因表達與p53功能之間的正反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　方法:
　　1.用FATS表達載體轉(zhuǎn)染細胞，24小時后提取細胞總蛋白或總RNA。用Westernblot實驗檢測細胞中

2、p53蛋白的表達量；進行RT-PCR實驗檢測細胞中p53mRNA表達水平，分析FATS對p53表達的影響。
　　2.用FATS表達載體或FATS-shRNA轉(zhuǎn)染細胞后，用蛋白合成抑制劑Cycloheximide(CHX)或DNA損傷化學誘導劑Etoposide處理細胞，Westernblot檢測細胞中p53蛋白的表達量，分析FATS對p53蛋白的穩(wěn)定性及DNA損傷后FATS對p53蛋白磷酸化和乙?；揎椀挠绊?。
　　3.FA

3、TS表達載體單獨或與p53表達載體共轉(zhuǎn)細胞后，免疫共沉淀(IP)法檢測FATS蛋白與p53蛋白的細胞內(nèi)相互作用。
　　4.用FATS原核表達載體GS-FATS(1-363)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導，純化GST-FATS(1-363)蛋白，用于蛋白質(zhì)相互作用研究。
　　5.利用體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)(TNT，Promega試劑盒)從p53表達載體直接得到純化的p53蛋白。
　　6.用純化的GST-FATS(

4、1-363)蛋白與p53蛋白進行體外蛋白結(jié)合(GST-pull-down)實驗，研究FATS蛋白N-端與p53蛋白是否發(fā)生直接的相互作用。
　　7.用染色質(zhì)免疫沉淀的方法檢測FATS對MEF(p53野生型)細胞中p53結(jié)合p21啟動子的影響。
　　8.用受控于p21基因啟動子的熒光酶報告基因載體pGL2-p21-1uc與p53、FATS表達載體單獨或共轉(zhuǎn)H1299(p53表達沉默)細胞，用熒光酶報告基因分析試劑盒和熒光酶活性

5、檢測儀檢測樣品中熒光酶活性，進一步分析FATS對p53轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組細胞相比較，F(xiàn)ATS過表達使細胞中p53蛋白的表達水平明顯升高；用FATS-shRNA抑制細胞內(nèi)源FATS表達之后，細胞中p53蛋白的表達量明顯降低。
　　2.FATS表達對p53mRNA表達水平?jīng)]有影響。
　　3.用蛋白合成抑制劑Cycloheximide(CHX)處理細胞后，F(xiàn)ATS表達能顯著抑制細胞內(nèi)p5

6、3蛋白的降解。
　　4.免疫共沉淀和GSTpull-down結(jié)果顯示FATS蛋白能與p53蛋白在體內(nèi)和體外發(fā)生相互作用，F(xiàn)ATS蛋白N端(1-363)區(qū)域直接與p53蛋白結(jié)合。
　　5.DNA損傷后，F(xiàn)ATS能進一步上調(diào)p53蛋白的表達量，并且增強p53蛋白的乙?；土姿峄?。
　　6.FATS表達能顯著提高p53下游靶基因p21的mRNA表達水平，并促進p53與p21啟動子的結(jié)合；熒光酶報告基因檢測結(jié)果顯示FATS

7、本身沒有轉(zhuǎn)錄因子活性，其對p21轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是p53依賴性的。
　　結(jié)論:
　　1.FATS通過增加p53穩(wěn)定性而誘導p53表達。
　　2.FATS是一個p53蛋白結(jié)合蛋白，通過其N-端與p53蛋白發(fā)生直接相互作用。
　　3.FATS促進DNA損傷后p53的激活，包括進一步增強p53蛋白穩(wěn)定性和其磷酸化、乙酰化修飾。
　　4.FATS上調(diào)p53蛋白的轉(zhuǎn)錄因子活性，是p53-p21信號通路的強有力正調(diào)控因子