犬CTLA-4胞外區(qū)編碼序列的克隆、表達(dá)與免疫佐劑作用的初步研究.pdf

1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)是活化的T淋巴細(xì)胞表面的一種與免疫信號傳遞有關(guān)的膜蛋白分子，由特征性的IgV胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成。CTLA-4能與CD28分子競爭結(jié)合B7分子，從而抑制T細(xì)胞活化，因此完整CTLA-4分子對免疫應(yīng)答起負(fù)調(diào)節(jié)作用。單獨(dú)的Igv胞外區(qū)雖能與B7分子結(jié)合，但不具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)，而能促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞(APC)對靶抗原的加工提呈，有可能成為一種新型的分子免疫佐劑。 本研究首先從犬外周血

2、分離淋巴細(xì)胞，經(jīng)CortA刺激活化后提取總RNA，然后用RT-PCR擴(kuò)增出大約400bp的IgV胞外區(qū)序列，將其克隆入T載體后進(jìn)行測序，結(jié)果顯示其核苷酸序列與已發(fā)表的CTLA-4全基因序列的胞外區(qū)同源性達(dá)到99.2％，在氨基酸水平同源性為98.4％，與B7分子結(jié)合的六肽基序(MYPPPY)沒有變化。然后將目的片段亞克隆入原核表達(dá)載體pQE-31中，在大腸桿菌中成功表達(dá)了約17KDa的重組蛋白，并用親和層析進(jìn)行了純化。 為了研究犬

3、CTLA-4胞外區(qū)的分子免疫佐劑作用，參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法，用DNAStar軟件包中的Protean程序?qū)θ?xì)小病毒(CPV)VP2蛋白進(jìn)行親水性和免疫原性分析，選擇親水性和抗原指數(shù)高的293-520位氨基酸區(qū)域(命名為VP2S)，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對引物，以含CPVVP2基因的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出預(yù)期大小的VP2S片段，將其分別定向克隆入原核表達(dá)載體pQE-31和pQE-31-CTLA4，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒

4、pQE-31-VP2S和pQE-31-CTLA4-VP2S。結(jié)果在大腸桿菌中成功表達(dá)了約29KDa的VP2S和42KDa的CTLA4-VP2S，Westem-blotting結(jié)果顯示，兩種重組蛋白能被CPV抗血清識別，證明目的蛋白的表達(dá)正確。用親和層析分別對VP2S和CTLA4-VP2S進(jìn)行純化，以純化的蛋白質(zhì)免疫小鼠，用間接ELISA測定兩種抗原免疫小鼠血清中的抗體水平，結(jié)果CTLA-4-VP2S免疫組的抗體產(chǎn)生時(shí)間及抗體滴度高峰出現(xiàn)