紫杉醇免疫佐劑作用與機(jī)理的初步研究.pdf

1、紫杉醇(Paclitaxel，或Taxol)是一種從紅豆杉(Taxus cuspidate cv.Nana.)中提取和分離出來(lái)的天然化合物。由于其對(duì)微管的穩(wěn)定作用而抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂和低毒性等特點(diǎn)，所以在人醫(yī)臨床上被廣泛用于治療乳腺癌。近年來(lái)的研究表明紫杉醇對(duì)免疫細(xì)胞具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)作用，能引起類(lèi)似于脂多糖所激發(fā)的天然免疫和特異性免疫反應(yīng)。因此，我們假設(shè)紫杉醇具有免疫佐劑功能，本論文進(jìn)行紫杉醇免疫佐劑作用的研究并對(duì)其佐劑作用機(jī)理進(jìn)行初步

2、探討。
　　 1、紫杉醇免疫佐劑作用研究
　　 目的以卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)作為模式蛋白抗原，研究紫杉醇的佐劑功能，以及對(duì)動(dòng)物免疫平衡的調(diào)節(jié)。方法試驗(yàn)一：將48只ICR小鼠隨機(jī)分成6組，生理鹽水組和對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含紫杉醇50μg、100μg、200μg和200μg鋁膠組。免疫2次，間隔3周。分別采集一免和二免后2周小鼠血清，檢測(cè)血清抗OVA抗體IgM、IgG及其亞類(lèi)。二免后從

3、各組小鼠中分離脾淋巴細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖和RT-PCR法檢測(cè)OVA刺激后細(xì)胞中細(xì)胞因子及其相關(guān)基因表達(dá)。試驗(yàn)二：將40只ICR小鼠隨機(jī)分成5組，對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含紫杉醇100μg、紫杉醇100μg(凍融)和鋁膠200μg、鋁膠200μg(凍融)組。免疫2次，間隔3周。分別收集一免和二免后2周小鼠血清，間接ELISA法檢測(cè)血清抗OVA抗體IgG水平。結(jié)果試驗(yàn)一中在含10μg OVA的抗原中添加100

4、μg紫杉醇能顯著提高小鼠一免和二免后血清中抗OVA特異性IgM和IgG滴度，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3水平，以及淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力(P<0.05)，顯著促進(jìn)了淋巴細(xì)胞合成細(xì)胞因子Interleukin-4(IL-4)，Interleukin-10(IL-10)，Interferon-γ(IFN-γ)和Interleukin-12(IL-12)以及促進(jìn)了GATA-3和T-bet表達(dá)(P<0.05)，試驗(yàn)二中添加100μg紫杉

5、醇疫苗經(jīng)過(guò)凍融后沒(méi)有影響到紫杉醇的佐劑效果，而添加200μg鋁膠佐劑組在凍融后明顯降低了其佐劑效果(P<0.05)。表明紫杉醇具有明顯的佐劑作用，并且在調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡上具有劑量依賴(lài)性；紫杉醇與鋁膠佐劑相比，更具有顯著的抗凍能力。
　　 2、體內(nèi)紫杉醇佐劑作用機(jī)理研究
　　 目的以卵清白蛋白OVA作為模式蛋白抗原，研究紫杉醇的佐劑功能是否通過(guò)Hsp90(Heat shock protein90)，細(xì)胞微管蛋白(β-

6、tubulin)和TLR4(Toll-likereceptor4)介導(dǎo)。方法試驗(yàn)一：將24只TLR4基因突變小鼠C3H/HeJ(TLR4-/-)和24只TLR4基因正常對(duì)照小鼠C3H/HeB(TLR4+/+)分別隨機(jī)分成4組，每組6只。對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含紫杉醇100μg和25μg LPS組。免疫2次，間隔3周。分別收集一免和二免后2周小鼠血清，檢測(cè)血清抗OVA抗體IgM、IgG滴度。試驗(yàn)二：將40只ICR小鼠隨

7、機(jī)分成5組，每組8只。對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含單獨(dú)紫杉醇100μg組和50μg格爾德霉素(Geldanamycin)組，以及100μg紫杉醇+50μg格爾德霉素組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測(cè)血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。試驗(yàn)三：將40只ICR小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只。對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含單獨(dú)紫杉醇100μg組和20μg秋水仙堿(Colchicine)組，以及100μg紫杉

8、醇+20μg秋水仙堿組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測(cè)血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。試驗(yàn)四：將40只ICR小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只。對(duì)照組僅免疫10μg OVA，其他組分別設(shè)含單獨(dú)紫杉醇100μg組和50μgpifithrin-a(PFT)組，以及100μg紫杉醇+50μg PFT組。在免疫后的第二周從小鼠眼靜脈叢采血，檢測(cè)血清抗OVA抗體IgM、IgG水平。結(jié)果試驗(yàn)一顯示小鼠TLR4受體突變顯著影響到了LPS的佐劑功

9、能(P<0.05)，但沒(méi)有影響到紫杉醇的佐劑功能。試驗(yàn)二顯示向紫杉醇佐劑組中添加格爾德霉素后顯著抑制了紫杉醇增強(qiáng)OVA特異性抗體水平(P<0.05)。試驗(yàn)三顯示向紫杉醇佐劑組中添加秋水仙堿后顯著提高了紫杉醇增強(qiáng)OVA特異性抗體水平(P<0.05)。試驗(yàn)四顯示向紫杉醇佐劑組中添加PFT后顯著抑制了紫杉醇增強(qiáng)OVA特異性抗體水平(P<0.05)。
　　 3、體外紫杉醇佐劑作用機(jī)理研究
　　 目的體外分析紫杉醇誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞系N

10、uclear factor kappa B(NF-κB)活化、細(xì)胞因子的分泌、共刺激分子表達(dá)、調(diào)節(jié)天然免疫的MicroRNA表達(dá)情況以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)外熱休克蛋白的影響。方法試驗(yàn)一：以穩(wěn)轉(zhuǎn)pNifty-2質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞為刺激對(duì)象，分別向細(xì)胞中加入不同終濃度的紫杉醇(0.01、0.1、1、10、100μM)刺激細(xì)胞24h，然后從培養(yǎng)基中檢測(cè)報(bào)告基因SEAP(分泌型堿性磷酸酶)的表達(dá)。試驗(yàn)二：方法同試驗(yàn)一，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌

11、的Tumor necrosisfactor-α(TNF-α)和interleukin-10(IL-10)細(xì)胞因子。試驗(yàn)三：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細(xì)胞2h或4h，通過(guò)Quantitative Real-time PCR法分析細(xì)胞內(nèi)miR-155，miR-147，miR-146和miR-132分子表達(dá)。試驗(yàn)四：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細(xì)胞3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h后，通過(guò)Real-time PCR法分析細(xì)胞內(nèi)

12、CD80和CD86分子表達(dá)。試驗(yàn)五：以10μM紫杉醇分別刺激巨噬細(xì)胞2h、4h、6h、8h后，通過(guò)Western blot分析細(xì)胞內(nèi)外Hsp60，Hsp70和Hsp90及其亞型的表達(dá)。結(jié)果紫杉醇具有活化巨噬細(xì)胞NF-κB的能力(P<0.05)；顯著提高巨噬細(xì)胞共刺激分子(CD80與CD86)表達(dá)(P<0.05)；促進(jìn)了巨噬細(xì)胞分泌TNF-a和IL-10(P<0.05)；提高了細(xì)胞內(nèi)miR-155，miR-147，miR-146和miR-

13、132分子表達(dá)(P<0.05)；促進(jìn)了巨噬細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)和Hsp90-α向細(xì)胞內(nèi)外的釋放。結(jié)合上一章的試驗(yàn)結(jié)果，暗示了內(nèi)源性Hsp90-α介導(dǎo)紫杉醇的佐劑作用。
　　 綜上所述，紫杉醇在體外能上調(diào)巨噬細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)，促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子的分泌，天然免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的MicroRNA分子的表達(dá)，以及細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)和Hsp90-α的釋放；體內(nèi)研究證明了紫杉醇顯著提高了小鼠對(duì)皮下注射OVA抗原的特異性體液免疫水平和細(xì)胞免