EP4受體拮抗劑抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居男性惡性腫瘤中的第2位。近年來我國PCa的發(fā)病率呈上升趨勢，目前在男性惡性腫瘤中居第3位，70歲以上PCa居泌尿男性生殖腫瘤發(fā)病率的第1位。在我國大多數(shù)PCa發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期或存在轉(zhuǎn)移，使得5年生存率低和病死率高成為我國PCa流行病學(xué)的主要特點(diǎn)。
　　PCa與雄激素關(guān)系密切，臨床上普遍運(yùn)用藥物或手術(shù)去勢阻斷雄激素治療晚期PCa，但大部

2、分雄激素依賴性PCa經(jīng)過治療終將進(jìn)展為雄激素非依賴性PCa（Androgen Independent Prostate Cancer,AIPC）。目前，治療AIPC尚缺乏有效方法，傳統(tǒng)的治療方法均無法明顯提高其生存期。骨轉(zhuǎn)移是PCa最常見最重要的轉(zhuǎn)移途徑，絕大部分的晚期PCa和AIPC均存在骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移及其并發(fā)癥可顯著降低前列腺癌患者的生存質(zhì)量和生存期，因此尋找新型有效的防治方法以有效治療PCa的（骨）轉(zhuǎn)移成為研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。

3、>　　炎癥在PCa的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，使用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drug,NSAID）特別是其選擇性環(huán)氧化酶2（Cyclooxgenase2,COX2）抑制劑可以治療和預(yù)防PCa。但是由于NSAID及COX-2抑制劑存在的胃腸道和心血管系統(tǒng)的不良反應(yīng)使這些研究取得的實(shí)際應(yīng)用成果極其有限。EP4是前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的4種特異性受體之一，作為

4、COX2的下游位點(diǎn)和PGE2的調(diào)控產(chǎn)物，EP4具有更高的選擇性和安全性。雖然研究表明其在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，選擇性地阻斷EP4受體可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，但迄今為止，EP4受體及其拮抗劑在PCa的發(fā)生發(fā)展特別是轉(zhuǎn)移中的作用報(bào)道很少，提示這一領(lǐng)域的研究仍處在早期探索階段。
　　目的：
　　本課題旨在通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉(zhuǎn)移性惡性表型及轉(zhuǎn)移瘤模型之間的關(guān)系。
　　1.在體外實(shí)驗(yàn)水平

5、，檢測EP4受體在激素依賴性PCa LNCaP細(xì)胞及AIPCPC3細(xì)胞中的表達(dá)，觀察不同EP4表達(dá)水平PCa細(xì)胞惡性表型的變化情況及EP4受體拮抗劑對各細(xì)胞轉(zhuǎn)移性惡性表型的抑制情況。
　　2.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平，探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.在體外實(shí)驗(yàn)水平，應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建EP4過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞（LNCaP/EP4+），應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime quant

6、itive polymerase chain reaction，Realtime qPCR）和免疫蛋白印跡法（Western-blot）檢測EP4受體mRNA和蛋白在激素非依賴性PCa LNCaP細(xì)胞、LNCaP/EP4+和AIPC PC3細(xì)胞中的表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察各細(xì)胞的侵襲能力變化及其與EP4表達(dá)的關(guān)系；以不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L）的EP4受體拮抗劑ONO-AE3-208作用于細(xì)胞，應(yīng)用

7、細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察EP4受體拮抗劑對細(xì)胞惡性表型的抑制作用；
　　2.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)水平，構(gòu)建熒光素酶（Luciferase）轉(zhuǎn)染的PC3/LUC細(xì)胞，應(yīng)用左心室注射法和局部注射法構(gòu)建小鼠PCa癌轉(zhuǎn)移模型。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用ONO-AE3-208作用于模型，對照組應(yīng)用超輕水（deuterium depleted water，DDW），應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)（IVIS Xenogen系統(tǒng)）觀察不同時(shí)期實(shí)驗(yàn)組與對照組小

8、鼠腫瘤生長大小及骨轉(zhuǎn)移發(fā)展情況并觀察小鼠轉(zhuǎn)移腫瘤的熒光負(fù)荷量，比較兩組之間的差異，觀察EP4受體拮抗劑對PCa骨轉(zhuǎn)移的作用。觀察PCa轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生發(fā)展情況，以探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。適當(dāng)時(shí)期將對照組小鼠處死后取PCa骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本HE染色觀察骨細(xì)胞破壞情況，分析EP4受體在PCa骨轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)合Realtime qPCR、Western-blot以及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，各

9、細(xì)胞的侵襲能力與細(xì)胞中EP4受體的表達(dá)水平呈現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。
　　2.應(yīng)用不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L）的EP4受體拮抗劑ONO-AE3-208作用于各細(xì)胞。細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示EP4受體拮抗劑對各細(xì)胞的增殖沒有影響（P>0.05）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EP4受體拮抗劑可以抑制細(xì)胞的遷移和侵襲（P<0.05）。
　　3.成功應(yīng)用左心室注射法和局部注射法構(gòu)建小鼠PCa癌全身骨轉(zhuǎn)移

10、模型和長骨局部轉(zhuǎn)移瘤模型，分別于注射后第20天和第15天觀察到轉(zhuǎn)移瘤生長，應(yīng)用活體生物發(fā)光成像技術(shù)（bioluminescence imaging，BLI）（IVIS Xenogen系統(tǒng)）顯示隨著時(shí)間變化實(shí)驗(yàn)組小鼠轉(zhuǎn)移腫瘤的熒光負(fù)荷量明顯低于對照組(P<0.01)。病理染色顯示可以觀察到對照組PCa骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本骨細(xì)胞破壞。
　　結(jié)論：
　　1.本研究結(jié)果表明PCa細(xì)胞EP4表達(dá)水平與細(xì)胞遷移及侵襲等轉(zhuǎn)移性惡性表型呈正相關(guān)。

11、
　　2.應(yīng)用EP4受體拮抗劑可以于體外抑制PCa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性惡性表型。
　　3.成功應(yīng)用左心室注射法構(gòu)建小鼠PCa癌全身骨轉(zhuǎn)移模型，為轉(zhuǎn)移性PCa體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提供了新的研究手段。
　　4.應(yīng)用EP4受體拮抗劑可以于體內(nèi)動(dòng)物模型中抑制PCa的轉(zhuǎn)移。
　　5.本研究為深入探索EP4受體及其拮抗劑在PCa中作用以及發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　綜上所述，本研究證明了EP4受體與PCa轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系，應(yīng)用選擇性EP4