COPD動態(tài)miRNA表達(dá)譜的構(gòu)建及血清miRNA分子標(biāo)志物的篩選與鑒定.pdf

1、背景:COPD是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率逐年增高與吸煙和大氣污染日益嚴(yán)重相關(guān)。COPD主要特征包括慢性支氣管炎和肺氣腫，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限和肺部異常炎癥反應(yīng)。COPD患者病情反復(fù)急性加重可以增加發(fā)病率和死亡率。吸煙是COPD發(fā)病最重要的危險因素，與95％的COPD發(fā)病有關(guān)。然而早期COPD患者缺乏特異性癥狀，目前尚無公認(rèn)COPD發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子標(biāo)志物，因此在COPD患者和高危人群中尋找分子標(biāo)志物，有助于COPD的早

2、期防治。miRNAs是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，通過與靶基因3'端非翻譯區(qū)結(jié)合發(fā)揮抑制翻譯作用或?qū)е耺RNA完全降解。目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)千種miRNAs，可參與調(diào)節(jié)許多重要生物學(xué)過程如:發(fā)育、凋亡、細(xì)胞增殖、造血等。miRNA在血清及血漿中非常穩(wěn)定地存在，可以抵抗內(nèi)源性RNA酶，在多種儲存條件和反復(fù)凍融情況下亦可保持穩(wěn)定。近年來研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA可能成為一些疾病的分子標(biāo)志物如:肺癌、胃癌、敗血癥和肺結(jié)核等。目前在COPD

3、發(fā)展過程中血清miRNA的相關(guān)研究甚少，僅一項土耳其小樣本研究發(fā)現(xiàn)COPD外周血清存在miRNA表達(dá)異常，且miRNA在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮何種作用仍不清楚，血清miRNA是否可能成為COPD早期診斷標(biāo)志物，有賴于進(jìn)一步深入研究。
　　目的:本研究擬通過建立COPD動態(tài)大鼠模型，了解肺部病理改變，同時對COPD不同時期大鼠肺組織進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，將差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析。并在此基礎(chǔ)上，選擇差異表達(dá)miRN

4、A在COPD患者外周血清中進(jìn)行檢測，以尋找COPD早期診斷分子標(biāo)志物。
　　方法:1、將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，包括對照組、吸煙2周組、吸煙4周組、吸煙6周組、吸煙8周組、吸煙15周+氣管內(nèi)滴注豬胰彈性蛋白酶組，每組各5只，建立香煙誘導(dǎo)COPD動態(tài)大鼠模型，同時進(jìn)行病理學(xué)觀察其形態(tài)學(xué)改變。2、取對照組、吸煙4周組、吸煙15周+氣管內(nèi)滴注豬胰彈性蛋白酶組大鼠肺組織各2例用于miRNA表達(dá)譜芯片分析。3、實時熒光定量PCR法

5、檢測異常表達(dá)miRNA，驗證芯片數(shù)據(jù)。4、運用生物信息學(xué)法對miRNA表達(dá)譜進(jìn)行靶基因預(yù)測、聚類分析及GO和Pathway分析。5、將研究對象分為健康對照組、重度吸煙組、COPD組，共收集各組外周血清及臨床資料。6、運用實時熒光定量PCR法檢測各組外周血清miR-21、miR-181a、miR-146a表達(dá)水平。7、對血清miR-21、miR-181a表達(dá)進(jìn)行ROC分析。
　　結(jié)果:1、成功建立COPD動態(tài)大鼠模型，大鼠肺組織出現(xiàn)

6、早期以炎癥細(xì)胞浸潤為主晚期出現(xiàn)肺氣腫改變的動態(tài)病理變化。2、成功建立miRNA動態(tài)表達(dá)譜，在熏煙4周組共有30個miRNAs異常表達(dá)，熏煙15周組共有37個miRNAs異常表達(dá)。3、對表達(dá)差異較明顯的6個miRNAs進(jìn)一步進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示miR-206、miR-146a、miR-147、miR-21、miR-181a和miR-92a-2*的變化趨勢與miRNA芯片數(shù)據(jù)一致，證實了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。4、生物信息學(xué)分析顯示異常表達(dá)的miR

7、NA可能與COPD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。5、共收集健康對照組41名、重度吸煙組40名、COPD組49名，重度吸煙組和COPD組外周血清miR-21較正常組增高，而miR-181a表達(dá)水平較正常組較低。COPD外周血清miR-21、miR-181a變化與肺功能相關(guān)。6、ROC分析結(jié)果顯示血清miR-21/miR-181a具有較高敏感性(85.4％)和特異性(85.0％），曲線下面積0.910（95％CI:0.846-0.974），有望成為CO