白紋伊蚊miRNA的測序、鑒定及表達譜的初步分析.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類大小約21-23個堿基的單鏈小分子非編碼RNA,能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯,從而對基因進行轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控[1]。大多數(shù)miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來,形成一個長度約幾百至上千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄木primarymiRNA(pri-miRNA)[2-4],primary miRNA既可以是單順反子結(jié)構(gòu)形成一個成熟的miRNA,也可以是多順反子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生多個

2、成熟miRNAs[2,5]。在果蠅中primarymiRNA在核內(nèi)被核糖核酸酶Drosha-Pasha復(fù)合物加工處理而最終成為具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體pre-miRNA(precursor miRNA),之后pre-miRNA被核輸出蛋白exportin-5轉(zhuǎn)運入胞質(zhì),接著被第二個核糖核酸酶Dicer-1消化為miRNA:miRNA*雙鏈復(fù)合物,隨后由解螺旋酶將其分解成兩條單鏈[6,7],多數(shù)情況下miRNA

3、*鏈快速降解而另一條鏈則成為成熟的miRNA,這個階段的miRNA可以結(jié)合RISC(RNA-Induced Silencing Complex)并與靶標mRNA的3'非翻譯區(qū)互補配對,miRNA和靶序列的互補程度決定了靶基因mRNA或者在翻譯水平被抑制,或者被降解[2]。植物體中降解是主要的工作方式,而哺乳動物中則以翻譯水平的抑制為主要方式。
　　 miRNA廣泛存在于動物、植物、細菌、病毒等多種生物物種中。研究表明大多數(shù)miR

4、NA在生物進化過程中高度保守,并且其表達具有時序性和組織特異性[2],現(xiàn)已證實miRNA參與和調(diào)控了包括細胞凋亡、癌癥發(fā)生、組織分化、發(fā)育、神經(jīng)元發(fā)育、炎癥、病毒感染等多個生理病理過程[8-13]。
　　 昆蟲miRNA的研究最早主要是以果蠅為模型展開,據(jù)推測,在果蠅的不同發(fā)育階段約有110種不同的miRNAs表達[14],通過軟件預(yù)測與同源比對分析的方法在岡比亞按蚊中發(fā)現(xiàn)66種miRNAs[15,16]。在斯氏按蚊miRNA研

5、究方面,通過小規(guī)模的測序以及Northern blot的方法首次實驗驗證了蚊蟲中miRNA的存在[17]。隨著近年來新一代高通量測序技術(shù)在small RNA研究領(lǐng)域的應(yīng)用,研究者已經(jīng)對埃及伊蚊以及致卷庫蚊的miRNA進行了深度測序分析[18,19]。到目前為止,在蚊蟲中共發(fā)現(xiàn)miRNA上百種,其中部分miRNA目前只在蚊蟲中發(fā)現(xiàn),尚未在其他物種中發(fā)現(xiàn)。通過對miRNA在蚊蟲從蟲卵到成蚊不同發(fā)育階段的表達譜分析,以及在雌蚊吸血前后的表達變

6、化,發(fā)現(xiàn)miRNA可能在蚊蟲的胚胎發(fā)育、組織分化、病原體感染過程中起到重要的調(diào)控作用[17,18]。對蚊蟲中miRNA功能以及作用機制的進一步了解,將有助于我們對蚊蟲的生長發(fā)育、繁殖、經(jīng)蚊蟲傳播的病原體感染等方面的研究。
　　 白紋伊蚊是登革病毒的重要傳播媒介,廣泛分布于我國南方大部以及東南亞地區(qū)[20]。2010年Rebecca L等[19]對白紋伊蚊C7/10細胞miRNA進行了深度測序,共鑒定出65種miRNAs。但有關(guān)白

7、紋伊蚊成蚊miRNA的研究尚未見報道,本實驗研究利用新一代高通量測序技術(shù)solexa測序?qū)Π准y伊蚊不同發(fā)育階段混合樣本的小RNA進行了深度測序,并通過后續(xù)的生物信息學分析鑒定并預(yù)測了上百種miRNAs,并且通過Northern blot的方法對部分miRNAs做了白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達譜分析以及在雌蚊吸血前后的表達變化。通過分析顯示miRNAs與白紋伊蚊的胚胎發(fā)育、變態(tài)發(fā)育以及吸血進程有關(guān),對其靶標的預(yù)測以及作用機制的進一步研究,將

8、有助于我們對白紋伊蚊各種生物學特性的了解,為將來的蚊蟲防控工作打下基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 1.通過新一代高通量測序技術(shù)solexa測序,對白紋伊蚊整個物種進行小RNA深度測序,并通過后續(xù)的生物信息學分析,對測得的每一條小RNA序列進行注釋,鑒定己知miRNA與目前尚未發(fā)現(xiàn)的新型miRNA。
　　 2.根據(jù)測序結(jié)果及相關(guān)文獻選取部分miRNA,通過Northern blot的方法實驗驗證白紋伊蚊中miRNA

9、的存在并對其不同發(fā)育階段做表達譜分析。對部分miRNA研究其在雌蚊吸血前后的表達變化。
　　 研究方法:
　　 1 白紋伊蚊small RNA的solexa測序
　　 1.1 白紋伊蚊樣本的收集
　　 分別收集12-24h蟲卵、早期幼蟲、晚期幼蟲、蟲蛹、羽化3-5天雄蚊、雌蚊等六個不同階段樣本。
　　 1.2 Total RNA的提取與鑒定
　　 將不同階段樣本收集后放液氮冷凍十分鐘,然后

10、用Trizol提取各個不同階段樣本的Total RNA,核酸測量儀檢測濃度及純度,15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提Total RNA的質(zhì)量。
　　 1.3測序
　　 樣品首先通過生物分析儀Agilent Bioanalyzer進行檢測,樣品合格后,首先將18-30 nt范圍的small RNA從Total RNA中分離出來,兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做RT-PCR擴增,然后利用測序儀對DNA片

11、段進行單向末端直接測序。
　　 1.4基本生物信息學分析
　　 對測序結(jié)果進行去接頭、去低質(zhì)量、去污染等處理,得到去雜質(zhì)的“干凈”序列,用于后續(xù)的高級分析。
　　 1.5高級生物信息學分析
　　 通過與rRNAetc(rRNA,tRNA,snRNA,snoRNA 等non-coding RaNAs)、已知的miRNA、repeat、exon/intron等降解片段的比對,將每條小RNA序列進行注釋。選擇沒

12、有比對上任何注釋信息的小RNA和與intron關(guān)聯(lián)的小RNA去預(yù)測新的miRNA。
　　 2.白紋伊蚊miRNA的表達譜分析以及雌蚊吸血前后的表達差異分析
　　 2.1 白紋伊蚊各個不同階段樣本的收集
　　 分別收集12-24h蟲卵、早期幼蟲、晚期幼蟲、蟲蛹、羽化3-5天雄蚊、未吸血雌蚊等六個不同發(fā)育階段樣本。
　　 2.2 Total RNA的提取與鑒定
　　 將不同階段樣本收集后放液氮冷凍10

13、min,然后按照mirVanaTM miRNAIsolation Kit中 Total RNA提取的相關(guān)步驟進行實驗,核酸測量儀檢測濃度及純度,15％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所提Total RNA的質(zhì)量。
　　 2.3 白紋伊蚊不同發(fā)育階段的miRNA表達譜分析
　　 分別取等質(zhì)量的六個不同發(fā)育階段樣本的Total RNA,依次進行電泳、半干轉(zhuǎn)印、交聯(lián)、雜交、洗膜、曝光檢測。
　　 2.4雌蚊吸血前后miR

14、NA的表達差異分析
　　 分別取等質(zhì)量的吸血與未吸血雌蚊樣本的Total RNA,依次進行電泳、半干轉(zhuǎn)印、交聯(lián)、雜交、洗膜、曝光檢測。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.通過對白紋伊蚊小RNA的深度測序以及生物信息學分析,共測得序列12663936條,1801570種。其中通過與miRBase14.0數(shù)據(jù)庫比對分析得到92種已知miRNAs,通過miRNA預(yù)測軟件mireap預(yù)測新的miRNAs 46種。
　　

15、 2.miRNA在白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達譜分析共選擇12種miRNAs進行驗證,包括6種保守性miRNAs與6種蚊蟲特異性miRNAs。所有的miRNAs在白紋伊蚊中均得到驗證,并且大多數(shù)miRNA在蚊蟲的不同發(fā)育階段具有表達差異。
　　 3.miRNA在白紋伊蚊雌蚊吸血前后的表達差異共選擇4種miRNAs(miR-184、miR-998、miR-989、miR-N1)做吸血前后的表達差異分析,其中3種miRNAs在雌蚊吸血

16、后表達水平增加,miR-N1在雌蚊吸血后才開始有表達。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.通過solexa高通量測序技術(shù),首次對白紋伊蚊這一物種的小RNA進行了深度測序,通過測序以及生物信息學分析共鑒定出已知miRNA 92種,預(yù)測新的miRNA 46種。
　　 2.通過Northern blot的方法,實驗驗證了白紋伊蚊中miRNA的存在,并且通過對白紋伊蚊不同發(fā)育階段的表達譜分析,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)miRNA表達具有期特異