血清microRNA(miRNA)作為胰腺癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、目前，全球胰腺癌新發(fā)病例多達(dá)23萬(wàn)/年。平均中位生存時(shí)間僅有4到6個(gè)月，已成為威脅我國(guó)人民生命健康的一大殺手。胰腺癌病人的5年生存率從早期病人的超過(guò)50％，迅速下降到進(jìn)展期病人的不足5％。雖然手術(shù)切除是較為有效的胰腺癌治療手段，但是一直以來(lái)由于缺乏良好的診斷標(biāo)志物，胰腺癌的診斷困難，尤其是早期胰腺癌的診斷缺乏特異的診斷標(biāo)志物一直是該疾病生存期短、預(yù)后不良的主要原因之一。目前臨床采用的影像學(xué)及一些標(biāo)志物如CEA，CA19-9等的敏感性和特

2、異性都不夠高。另外，胰液的分子標(biāo)志物、胰腺管刷檢、組織穿刺等方法也在臨床中有所應(yīng)用，但是這些方法操作復(fù)雜，標(biāo)本取材困難，臨床應(yīng)用存在一定難度。對(duì)于胰腺癌病人如能早期診斷，早期手術(shù)切除將大大改善病人的預(yù)后與生存。本研究的目的主要是鑒定胰腺癌特異的血清miRNA表達(dá)譜，驗(yàn)證其作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的特異性與敏感性，并觀察其與胰腺癌病人生存及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　miRNA(microRNA)是一類長(zhǎng)約19-23個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA

3、，它由一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。miRNA通過(guò)與目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’-UTR)互補(bǔ)配對(duì)，使目標(biāo)mRNA分子的翻譯受到抑制或引起特異性的對(duì)mRNA分子的切割，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。大量研究成果表明，miRNA參與著生物體中很多基本生命過(guò)程的調(diào)控，在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用，miRNA分子不僅自身作為功能分子發(fā)揮作用，還廣泛參與和決定基因表達(dá)調(diào)控和蛋

4、白質(zhì)翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞的新陳代謝等所有生命過(guò)程。miRNA標(biāo)志物將成為疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因標(biāo)志物、蛋白質(zhì)標(biāo)志物和代謝物標(biāo)志物整體“網(wǎng)絡(luò)”中的“結(jié)點(diǎn)”。雖然腫瘤組織中的miRNA可以作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，但是，為了獲得腫瘤組織miRNA，勢(shì)必需要進(jìn)行有創(chuàng)的手術(shù)或者穿刺等，所以組織miRNA仍然不能滿足早期診斷的需要，仍然不能適用于廣泛的篩查和預(yù)防?；诖耍芯咳藛T將目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收集到的血液。血清的檢測(cè)是無(wú)創(chuàng)的、

5、非侵入的，因此可以適用于普查和預(yù)防，為早期診斷服務(wù)。隨著miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)血清、血漿及其它體液中存在miRNA，并發(fā)現(xiàn)這些體液來(lái)源的miRNA能非侵入地診斷腫瘤等疾病及判斷預(yù)后。
　　本研究收集了157份胰腺癌及138份年齡性別相匹配的正常對(duì)照。初步采用單分子微陣列(solexa)高通量小分子測(cè)序?qū)山M病人的混合血清進(jìn)行篩選，得出差異表達(dá)的血清miRNA，隨后通過(guò)定量PCR(qRT-PCR)對(duì)初篩階段差異表達(dá)的血清mi

6、RNA進(jìn)行大規(guī)模、單樣本、二階段的精確定量驗(yàn)證。通過(guò)聚類分析、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析、曲線下面積分析評(píng)估該組血清miRNA表達(dá)譜對(duì)胰腺癌診斷的準(zhǔn)確性及可靠性。另選取82例慢性胰腺炎作為第二對(duì)照，進(jìn)一步驗(yàn)證該組標(biāo)志物對(duì)胰腺癌病人和其高危人群慢性胰腺炎的區(qū)分能力。進(jìn)一步選取69例樣本(胰腺癌+正常對(duì)照)進(jìn)行雙盲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，操作者與結(jié)果分析者均不知曉樣本信息前提下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及分析驗(yàn)證其診斷的準(zhǔn)確性。另選取55例臨床疑似胰腺癌的病例進(jìn)行前瞻性分析，結(jié)合后續(xù)該

7、55例樣本的臨床病理診斷來(lái)評(píng)價(jià)該組血清miRNA作為胰腺癌診斷生物標(biāo)志物的準(zhǔn)確性。
　　通過(guò)初步高通量的Solexa測(cè)序篩選及qRT-PCR驗(yàn)證過(guò)程，得到7個(gè)在胰腺癌與正常對(duì)照樣本間穩(wěn)定差異表達(dá)的miRNA，即：miR-20a，miR-21，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-185，及miR-191。采用風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)7個(gè)miRNA表達(dá)系統(tǒng)對(duì)胰腺癌的診斷能力。該組血清miRNA作為標(biāo)志物能夠?qū)⒏鞣N階段

8、的胰腺癌與正常對(duì)照樣本以較高的敏感性和特異性區(qū)分開來(lái)，而且，同樣能夠準(zhǔn)確的區(qū)分胰腺癌與慢性胰腺炎病例，表明該組標(biāo)志物是胰腺癌的特異性標(biāo)志物。進(jìn)一步構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC)，先采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方法分別評(píng)估所有樣本的7個(gè)血清miRNA的敏感性及特異性，由此構(gòu)建ROC，對(duì)于第一驗(yàn)證階段及第二驗(yàn)證階段得到的曲線下面積(AUC)分別是0.992及0.985。通過(guò)對(duì)7個(gè)血清miRNA與生存時(shí)間的分析發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達(dá)水平與病人的生存期有著

9、明顯的相關(guān)性，可以作為預(yù)后因子對(duì)病人的預(yù)后起到提示作用，miR-21高表達(dá)的病人預(yù)后相對(duì)較差。通過(guò)多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以69例樣本(胰腺癌+正常對(duì)照)進(jìn)行雙盲驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該組標(biāo)志物的敏感性與特異性分別為86.5％及87.5％。高于CA19-9(敏感性70.0％，特異性68.9％)及CEA(敏感性71.4％，特異性73.3％)的敏感性與特異性。以7個(gè)血清miRNA作為標(biāo)志物對(duì)55例

10、高度疑似胰腺癌的初診病人進(jìn)行檢測(cè)，后通過(guò)隨訪經(jīng)臨床病理確診診斷，該血清標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確率為83.64％。
　　通過(guò)以上研究鑒定出的7個(gè)血清miRNA能夠準(zhǔn)確的區(qū)別胰腺癌與正常對(duì)照樣本及慢性胰腺炎樣本，該組標(biāo)志物可以改進(jìn)單一的分子標(biāo)記物所難以克服的低特異性和低靈敏度問題，能顯著提高胰腺癌的臨床檢出率，成為早期診斷的有效手段。7個(gè)血清miRNA作為一種新奇的無(wú)創(chuàng)胰腺癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物具有良好的臨床應(yīng)用潛力。如能將血清miRNA推廣應(yīng)用