FJ1的抗炎癥和帕金森癥作用及機(jī)制研究.pdf

1、3β-當(dāng)歸酰氧基-8β，10β-二羥基佛術(shù)烯-7(11)-烯-12，8α-內(nèi)酯(FJ1)是從傳統(tǒng)中藥大吳風(fēng)草中提取的活性化合物。大吳風(fēng)草為多年生草本菊科植物，其藥用全株叫做蓮蓬草，主要分布于中國(guó)的東南部和南部、日本、韓國(guó)[1]，對(duì)于例如感冒、咳嗽、炎癥等多種疾病均有良好療效[2]，因此推測(cè)其活性提取物具有抗炎癥作用。課題中研究的FJ1是本實(shí)驗(yàn)室由大吳風(fēng)草中提取的多種活性產(chǎn)物經(jīng)篩選后確定的考察對(duì)象。
　　炎癥是機(jī)體對(duì)由微生物感染和其

2、他傷害性刺激造成的組織損傷的響應(yīng)，是一種十分常見(jiàn)同時(shí)也非常重要的防御機(jī)制[3]，然而，低分辨率和不受控制的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致一種與包括癌癥在內(nèi)的多種人類(lèi)疾病有關(guān)的慢性炎癥狀態(tài)[4][5]。本課題旨在驗(yàn)證FJ1的抗驗(yàn)證活性并闡明其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(LPS，Lipopolysaccharide)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型[6]。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FJ1的細(xì)胞毒活性以及對(duì)LPS損傷細(xì)胞的保護(hù)活性，結(jié)果表明，

3、二者均具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性，細(xì)胞毒在安全范圍內(nèi)，F(xiàn)J1能夠提高保護(hù)組細(xì)胞活性。利用一氧化氮試劑盒測(cè)定NO的產(chǎn)生量[7-8]，結(jié)果顯示FJ1明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7產(chǎn)生NO量，且呈劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧水平，結(jié)果與上述結(jié)論相符。蛋白免疫印跡法考察ERK，p38，JNK，p-ERK，p-p38，p-JNK[9]，NF-κB，IκB-α，p-IκB-α[10]的蛋白表達(dá)水平變化[11]，結(jié)果表明，ERK，p38，JN

4、K蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，p-ERK，p-p38，p-JNK，NF-κB，p-IκB-α[12]的蛋白表達(dá)水平隨著FJ1濃度升高而降低[13]，而IκB-α蛋白表達(dá)水平則隨著FJ1濃度升高而增加。RT-PCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因iNOS，COX-2，TNF-α的RNA表達(dá)水平[14][15]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三那者均隨著FJ1濃度的升高而顯著降低。綜上所述，F(xiàn)J1對(duì)炎癥細(xì)胞模型具有顯著的保護(hù)作用，提示FJ1的潛在抗炎癥活性可能成為我國(guó)傳統(tǒng)中藥對(duì)

5、世界醫(yī)藥發(fā)展的又一貢獻(xiàn)[16]。
　　帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病[17]，其臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙，同時(shí)患者可伴有抑郁[18]、便秘和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，給患者及其家屬帶來(lái)巨大的痛苦[19]。帕金森癥與氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)聯(lián)[20]，F(xiàn)J1在抗炎癥活性探討中表現(xiàn)出來(lái)的抗氧化活性提示我們其潛在的抗帕金森癥活性。經(jīng)典的帕金森癥細(xì)胞模型是由1

6、-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12細(xì)胞株構(gòu)建而成[21]，百草枯(PQ)是一種常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)毒素，其結(jié)構(gòu)與MPTP的活性部分MPP+相近，因此近年來(lái)多被用于構(gòu)建新型帕金森癥模型[22]，本研究采用此種模型，也是本實(shí)驗(yàn)室首次自行構(gòu)建此模型，因此需要對(duì)其各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PQ的細(xì)胞毒活性[23]，結(jié)果顯示PQ抑制PC12增殖，且具有明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)

7、胞線粒體膜電勢(shì)[24]以及細(xì)胞凋亡[25]，結(jié)果表明高濃度PQ使細(xì)胞膜電勢(shì)下降，誘導(dǎo)PC12凋亡。上述結(jié)果均與已報(bào)道的MPTP以及其他實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建該模型的數(shù)據(jù)相符，可用作后續(xù)研究中的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)。在FJ1對(duì)PC12的保護(hù)活性研究中，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FJ1對(duì)PQ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性的影響，結(jié)果表明FJ1對(duì)受損細(xì)胞具有保護(hù)作用且具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性氧水平[26]，細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)以及細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示FJ1能夠抑制

8、由PQ導(dǎo)致的ROS和凋亡的增長(zhǎng)，提高M(jìn)MP水平。蛋白免疫印跡法[27]考察ERK，p38，JNK，p-ERK，p-p38，p-JNK，Bcl-2，Bax的蛋白表達(dá)水平變化[28]，結(jié)果表明，ERK，p38，JNK蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，p-ERK，p-p38，p-JNK，Bcl-2的蛋白表達(dá)水平隨著FJ1濃度升高而降低，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)水平則隨著FJ1濃度升高而增加。
　　本論文首次研究了本實(shí)驗(yàn)室提取的大吳風(fēng)草活性提取物FJ1的