水痘-帶狀皰疹病毒新型減毒疫苗株V-7D與ORF7蛋白功能研究.pdf

1、水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是一種全球性普遍存在的對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有高度趨向性的人類皰疹病毒，主要引發(fā)兩種不同臨床表現(xiàn)的疾病:初次感染可引發(fā)水痘（varicella or chickenpox），長(zhǎng)期潛伏再激活后可引發(fā)帶狀皰疹（herpeszoster or shingles）。水痘是一種具有高度傳染性的兒童常見(jiàn)皮膚疾病，帶狀皰疹則多發(fā)于中老年人以及免疫妥協(xié)或缺陷的病人，并隨著年齡增大而發(fā)病率顯

2、著增加，具有嚴(yán)重的危害性。目前仍缺乏水痘和帶狀皰疹的特效治療藥物，接種疫苗是預(yù)防水痘和帶狀皰疹的最經(jīng)濟(jì)有效的措施。vOka株是目前使用的水痘/帶狀皰疹減毒活疫苗株，但研究已顯示，vOka株雖然可在人皮膚中減毒，但仍具有感染和潛伏人神經(jīng)系統(tǒng)的能力，其安全隱患不容忽視。因此，開(kāi)發(fā)新型的更為安全有效的水痘-帶狀皰疹疫苗已成為當(dāng)前的迫切需求。在前期研究中，我們與合作實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)VZV體外復(fù)制的非必需基因orf7是VZV體內(nèi)感

3、染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織的雙嗜性決定因子，同時(shí)ORF7敲除的VZV毒株可在人T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞中擴(kuò)增。這提示了ORF7表達(dá)缺失VZV毒株具有發(fā)展為新型水痘-帶狀皰疹減毒活疫苗候選株的潛力。本研究即在此基礎(chǔ)上，探索構(gòu)建ORF7缺失的新型VZV候選疫苗株，并開(kāi)展病毒學(xué)、毒力和免疫原性等研究，分析其發(fā)展為新型水痘-帶狀皰疹疫苗的可行性，同時(shí)進(jìn)一步對(duì)ORF7的功能以及ORF7表達(dá)缺失的減毒機(jī)制進(jìn)行探索，為VZV的防治方法研究提供基礎(chǔ)。
　

4、　本研究首先應(yīng)用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了不包含報(bào)告基因等非病毒株來(lái)源基因序列的新型ORF7表達(dá)缺陷減毒株V-7D，通過(guò)PCR鑒定、基因測(cè)序、蛋白印跡法檢測(cè)等方法驗(yàn)證構(gòu)建的V-7D的ORF7抗原表達(dá)缺陷，符合預(yù)期設(shè)計(jì)。MRC-5細(xì)胞是一種人胚肺成纖維二倍體細(xì)胞，已被較廣泛應(yīng)用于包括現(xiàn)有水痘疫苗在內(nèi)的多種人用疫苗的制備。本研究評(píng)價(jià)了V-7D在MRC-5細(xì)胞中的培養(yǎng)特性。結(jié)果顯示，V-7D可以在MRC-5細(xì)胞中高效復(fù)制，其效價(jià)與vOka株相當(dāng)。本

5、研究進(jìn)一步應(yīng)用透射電鏡對(duì)V-7D與原型毒株pOka感染后的MRC-5細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)。結(jié)果顯示，V-7D與pOka在感染MRC-5細(xì)胞中的病毒顆粒數(shù)量、分布及超微結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯差別。同時(shí)，本研究應(yīng)用蔗糖密度梯度離心與蛋白印跡法分別分析了V-7D、vOka與pOka在感染后MRC-5細(xì)胞的裂解上清（疫苗主要成分）中的主要病毒抗原的差異。結(jié)果顯示，除V-7D組不能檢測(cè)到ORF7抗原外，V-7D、vOka與pOka組在其它包括病毒糖蛋白、衣殼蛋白以

6、及典型皮層蛋白在內(nèi)的主要病毒抗原的含量與分布均未見(jiàn)明顯差異。上述結(jié)果說(shuō)明，本研究成功構(gòu)建了ORF7表達(dá)缺陷的新型VZV候選疫苗株V-7D，其可在人二倍體細(xì)胞株MRC-5中高效增殖;ORF7的表達(dá)缺陷并不會(huì)顯著影響VZV在MRC-5細(xì)胞中的組裝，以及細(xì)胞裂解上清病毒主要抗原的含量與分布。
　　為驗(yàn)證V-7D對(duì)人類VZV易感組織的感染能力，本研究構(gòu)建了人胸腺、皮膚、背根神經(jīng)節(jié)移植的SCID-hu人鼠嵌合模型，并應(yīng)用上述模型開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)

7、。通過(guò)將不同毒株分別感染人皮膚、背根神經(jīng)節(jié)移植的嵌合模型小鼠，在感染后不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用PCR、免疫組織化學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，本研究構(gòu)建ORF7表達(dá)缺陷的V-7D株無(wú)法有效感染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織，而原型對(duì)照毒株pOka則可高效感染人皮膚和背根神經(jīng)節(jié)組織。為更好地驗(yàn)證ORF7缺陷對(duì)VZV毒力的影響，本研究首次在SCID-hu人鼠嵌合模型中模擬了VZV天然感染的過(guò)程。結(jié)果顯示，VZV-7D與對(duì)照VZV-ROka株均可以經(jīng)樹(shù)突狀細(xì)胞感

8、染人胸腺組織T細(xì)胞;隨后分離出感染后的人胸腺T細(xì)胞并靜脈接種人皮膚嵌合模型小鼠，其中VZV-ROka可通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)成功感染人皮膚組織，而VZV-7D無(wú)法通過(guò)感染T細(xì)胞的介導(dǎo)再感染嵌合模型小鼠的人皮膚組織。上述結(jié)果說(shuō)明，ORF7表達(dá)缺失的VZV毒株具有發(fā)展成為新型水痘或帶狀皰疹疫苗所必需的安全性特征。
　　本研究進(jìn)一步對(duì)V-7D的免疫原性進(jìn)行研究。應(yīng)用與vOka株相同的方法制備V-7D疫苗原液，再將V-7D與vOka以相同劑量分別

9、對(duì)大鼠和豚鼠進(jìn)行免疫，評(píng)價(jià)其激活體液與細(xì)胞免疫反應(yīng)的水平。在體液免疫反應(yīng)方面，應(yīng)用gpELISA和膜抗原熒光抗體實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)結(jié)果顯示，V-7D和vOka免疫后動(dòng)物血清中的VZV抗體滴度均顯著升高，二者激活體液免疫反應(yīng)的水平相當(dāng)。在細(xì)胞免疫反應(yīng)方面，V-7D和vOka免疫后大鼠的脾細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)病毒刺激分泌的IFN-γ水平與陰性對(duì)照組相比均顯著提高，其反應(yīng)水平亦基本相當(dāng)。同時(shí)，本研究應(yīng)用SCID-hu人鼠嵌合模型研究了V-7D與VZV-pOk

10、a接種人皮膚和胸腺組織后激活固有免疫反應(yīng)的情況。結(jié)果顯示，V-7D和pOka接種人皮膚后都能在短時(shí)間內(nèi)顯著提高組織促炎癥細(xì)胞因子的分泌水平，其中pOka因?yàn)槟軌蚋腥酒浼せ畹墓逃忻庖叻磻?yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，V-7D則因?yàn)闊o(wú)法感染其激活的固有免疫反應(yīng)會(huì)逐漸恢復(fù)到陰性水平;另一方面，人T細(xì)胞對(duì)V-7D和pOka感染的固有免疫反應(yīng)較低，甚至出現(xiàn)固有免疫能力下降的趨勢(shì)。上述結(jié)果說(shuō)明，V-7D具有與vOka株相當(dāng)?shù)拿庖咴裕捎行Ъせ顧C(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免

11、疫以及固有免疫反應(yīng)，具有發(fā)展為新型疫苗的良好潛力。
　　本研究進(jìn)一步對(duì)ORF7的功能和作用機(jī)制進(jìn)行探索，主要包括ORF7蛋白性質(zhì)鑒定、ORF7相關(guān)蛋白-蛋白相互作用和ORF7功能域分析研究。(1)在ORF7的蛋白性質(zhì)方面，本研究首次通過(guò)實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明了ORF7屬于VZV皮層蛋白，并且ORF7包裝進(jìn)入病毒顆粒皮層依賴于其高爾基體定位，而ORF7的高爾基體定位又依賴于ORF7 N端保守的第9位保守半胱氨酸以及VZV未知功能蛋白的調(diào)控。另

12、外，本研究還鑒定出ORF7屬于磷酸化蛋白，其中（病毒感染或細(xì)胞轉(zhuǎn)染）真核表達(dá)的ORF7具有絲氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾，而原核表達(dá)ORF7僅具有酪氨酸磷酸化修飾;在體外激酶實(shí)驗(yàn)中，原核表達(dá)ORF7能夠被病毒蛋白激酶ORF47絲氨酸磷酸化，因此ORF7屬于ORF47激酶底物。本研究通過(guò)軟件預(yù)測(cè)獲得多個(gè)ORF7潛在磷酸化位點(diǎn)，其中ORF7 N端20-23 aa的“SYEE”序列中包含了ORF47底物磷酸化的共有序列及保守的酪氨酸位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)該

13、序列的點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn)，ORF7第20位絲氨酸突變不影響其整體絲氨酸磷酸化水平，但是ORF7第21位保守酪氨酸突變后其酪氨酸磷酸化水平明顯減弱。(2)在ORF7相關(guān)蛋白-蛋白相互作用研究方面，本研究制備了針對(duì)VZV25種主要結(jié)構(gòu)蛋白的多抗血清或單克隆抗體，并與前期研究獲得的VZV抗體組成可用于檢測(cè)VZV33種重要抗原的抗體庫(kù)。接著，本研究應(yīng)用免疫共沉淀的方法從VZV-ROka感染的ARPE-19細(xì)胞中篩選出與ORF7相互作用的10種病毒蛋

14、白，應(yīng)用試劑盒從7390種人源性蛋白庫(kù)中篩選出與ORF7相互作用的66種宿主細(xì)胞蛋白。隨后，本研究應(yīng)用293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了ORF7與ORF47和GRASP65存在直接相互作用，但與ORF9沒(méi)有直接相互作用。最后，本研究在VZV-ROka和VZV-7D感染的ARPE-19細(xì)胞中觀察到與ORF7相互作用的4種VZV蛋白的亞細(xì)胞定位及其與細(xì)胞骨架相互作用在ORF7敲除后出現(xiàn)異常。(3)在ORF7功能域分析方面，本研究確定了O

15、RF7 N端序列存在影響VZV體外與體內(nèi)毒力的關(guān)鍵功能域，而ORF7至少66 aa到C端的全部氨基酸序列對(duì)VZV的毒力無(wú)任何影響。另一方面，突變ORF7 N端高爾基體定位信號(hào)后雖影響了ORF7在病毒皮層內(nèi)的包裝以及VZV在體外細(xì)胞上的毒力，但是卻不影響病毒在體內(nèi)人皮膚和DRG組織中的毒力，該結(jié)果提示了ORF7 N端存在影響VZV毒力的不同功能域。
　　綜上所述，本研究獲得了具有良好成苗性、安全性和免疫原性特征的新型減毒疫苗株V-7