牛同種及山羊-牛異種克隆胚胎體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、本實驗旨在對?？寺∨咛ヒ约吧窖?牛核移植胚胎的體外培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并且研究了在培養(yǎng)過程中不同時間添加不同大分子物質對于胚胎發(fā)育的影響。從而建立一套較為系統、穩(wěn)定、高效的胚胎培養(yǎng)體系，提高胚胎體外囊胚發(fā)育率，為提高制作轉基因動物、克隆動物、試管動物等的效率提供技術平臺，為該技術走出實驗室，在實踐中得以應用提供理論依據。試驗設計結果為： 1.以DMEM為基礎培養(yǎng)液，對供體牛以及山羊胎兒耳朵組織塊進行組織塊法培養(yǎng)，又以0.2％膠原酶Ⅱ

2、和0.25％胰蛋白酶(Trypsin)按2：3的比例配成混合消化液消化山羊胎兒供體組織，以2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA(Gibco BRL)消化液消化牛胎兒供體組織，結果兩種方法都獲得了體外培養(yǎng)的胎兒耳朵成纖維細胞。可在含10％DMSO(二甲亞諷)的冷凍液中于-70℃條件下短期凍存，也可在-196℃條件下長期保存。 2.通過細胞質內注射法將牛和山羊胎兒耳朵成纖維細胞移入去核的牛卵母細胞中構建重組胚胎以及山羊

3、-牛異種胚胎，分別采用mCR2aa以及mSOF進行培養(yǎng)，結果表明：mSOF液中培養(yǎng)同種胚胎和異種胚胎的卵裂率、8/16-cell發(fā)育率，囊胚發(fā)育率以及囊胚細胞數均明顯高于mCR2aa中的培養(yǎng)結果。(同種依次為74.4±6.5％Vs54.2±4.3％、45.1±6.2％Vs31.5±2.9％、18.5±2.3％Vs9.3±1.8％以及98.2±4.3 Vs78.4±4.1，異種依次為46.6±3.7％Vs36.4±5.1％、30.4±3.

4、8％Vs 20.3±3.2％、8.8±2.1％Vs 3.7±1.5％以及81.1±3.2 Vs68.0±2.5)(P<0.05)。 3.在mSOF中按不同培養(yǎng)時間添加8mg/mlBSA或者10％FBS，培養(yǎng)前三天和培養(yǎng)三天后添加的補充物質及次序為：(1)BSA+FBS；(2)BSA+BSA；(3)FBS+BSA；(4)FBS+FBS。結果表明：添加NBSA+FBS和BSA+BSA的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的同種胚胎和異種胚胎卵裂率(同種為7

5、9.8±7.1％及74.0±3.6％，異種為40.1±6.3％及36.2±2.7％)均比添加FBS+BSA，FBS+FBS的培養(yǎng)體系結果明顯高(同種為49.8±5.1％及49.5±2.4％，異種為26.1±3.2％及23.4±2.8％)(P<0.05)。添加BSA+FBS培養(yǎng)的同種胚胎及異種胚胎的8/16-cell發(fā)育率，囊胚發(fā)育率和轉基因牛數均比其他組高(同種8/16-cell發(fā)育率為49.7±3.5％Vs37.5±2.6％Vs20.

6、4±2.4％Vs19.0±2.1％；同種囊胚發(fā)育率為：21.5±1.8％Vs10.9±2.0％Vs5.0±2.3％Vs4.3±2.0％；同種囊胚細胞數依次為115.2±4.3 Vs 103.4±4.4 Vs 101.1±5.2 Vs 102.9±7.7，異種8/16-cell發(fā)育率為29.2±2.0％Vs18.1±2.2％Vs19.9±2.8％Vs18.2±2.6％；異種囊胚發(fā)育率為13.4±2.1％Vs6.9±2.1％Vs3.3±1.