外源谷胱甘肽對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、氧化還原平衡對(duì)于胚胎發(fā)育來說是及其重要的，外源添加抗氧化劑對(duì)于胚胎維持氧化還原水平起到積極作用。研究表明，谷胱甘肽(GSH)是一種極其重要的抗氧化劑，能消除部分有害的氧化自由基(ROS)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。本文旨在探究外源GSH對(duì)牛體外受精胚胎發(fā)育的影響和作用機(jī)制。
　　為從胚胎的體外發(fā)育能力和囊胚質(zhì)量方面研究GSH對(duì)牛體外受精胚胎的影響，在胚胎培養(yǎng)液中按濃度梯度添加GSH，統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育的卵裂率、4細(xì)胞率、8-16細(xì)胞率、桑

2、椹胚率和囊胚率，以篩選其最適濃度;同時(shí)，通過對(duì)幾種囊胚染色方法的效果比較，建立一種囊胚的三重染色方法;并采用該方法測(cè)定了囊胚總細(xì)胞數(shù)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比例和凋亡細(xì)胞比例，探索GSH對(duì)胚胎抗氧化過程中的作用效果。結(jié)果表明，兩種一抗或兩種二抗同時(shí)孵育，能在保證染色質(zhì)量的前提下大大縮短染色時(shí)間，提高染色效率;而且，可在同一枚囊胚中區(qū)分滋養(yǎng)層細(xì)胞、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和凋亡細(xì)胞，提高囊胚質(zhì)量分析的準(zhǔn)確性。另外，在培養(yǎng)液中添加3mMGSH時(shí)，牛體外受精囊胚的發(fā)育率最

3、高(51％)，顯著高于對(duì)照組(30％，P＜0.05);囊胚總細(xì)胞數(shù)顯著高于其他組(p＜0.05)，囊胚質(zhì)量最佳?？梢?，胚胎培養(yǎng)液中添加GSH能促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育，其最適添加濃度為3mM。
　　其次，在最適添加濃度下對(duì)胚胎內(nèi)源GSH和ROS的含量進(jìn)行檢測(cè)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)胚胎發(fā)育（Oct4，Sox2和Klf4）、GSH合成相關(guān)基因（Gclm，Gclc和Gss）和GSH代謝相關(guān)基因(Gstp, Gstm和Gpx)的表達(dá)水

4、平進(jìn)行了測(cè)定，以期揭示GSH能提高胚胎發(fā)育能力的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，GSH處理能夠顯著提高2-4細(xì)胞期胚胎內(nèi)源GSH含量，降低2-4細(xì)胞期胚胎ROS含量(p＜0.05)，而對(duì)其他發(fā)育階段的胚胎則差異不顯著。另外，對(duì)胚胎相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，并沒有檢測(cè)到顯著的變化(p＞0.05)。說明外源GSH對(duì)胚胎內(nèi)源GSH的合成和代謝沒有顯著影響。
　　再者，收集GSH處理8-16細(xì)胞期胚胎和桑椹胚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平研究GSH對(duì)

5、胚胎抗氧化作用的影響，同時(shí)也進(jìn)行了牛胚胎lncRNA的篩選，并對(duì)其靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示胚胎經(jīng)GSH處理后經(jīng)歷了更為復(fù)雜的生物過程，其中GSH代謝通路表現(xiàn)活躍，因此GSH可能是通過調(diào)節(jié)胚胎內(nèi)GSH代謝通路來進(jìn)一步影響胚胎發(fā)育。通過篩選胚胎內(nèi)lncRNA，共篩選出4275條lncRNA。經(jīng)更深層次篩選，共篩選出5條表達(dá)量較高，且影響較大的lncRNA，其中CUFF.21976.3可能影響其周圍ATP6V1C2、RRM2、GRHL1、KL