過(guò)表達(dá)IDH1R132H對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究IDH1R132H對(duì)GBM細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，并探索其相關(guān)的分子機(jī)制，為GBM的個(gè)體化治療提供更充分的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)和可能的治療靶點(diǎn)。
　　方法:構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87 GBM細(xì)胞系，并通過(guò)Western blot驗(yàn)證。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)IDH1R132H對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)IDH1R132H對(duì)U87細(xì)胞遷移能力的影響，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)ID

2、H1R132H對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響。分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中IDH1R132H GBM中miR-128a的表達(dá)水平，Real-time PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87細(xì)胞中miR-128a的表達(dá)水平。通過(guò)Western blot分析HIF-1α在過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87細(xì)胞中的表達(dá)水平，并且使用HIF-1α抑制劑處理IDH1R132H U87細(xì)胞觀察其對(duì)miR-128a表達(dá)水平的影響，分析miR-128a基因啟動(dòng)子

3、序列并通過(guò)Chip實(shí)驗(yàn)分析IDH1R132H U87細(xì)胞中HIF-1α和miR-128a的結(jié)合情況。采用miR-128amimics或miR-128a inhibitor干預(yù)U87細(xì)胞，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-128a對(duì)IDH1R132H U87細(xì)胞以及IDH1wT U87細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)Bmi-1在IDH1R132H U87細(xì)胞、miR-128amimics和miR-1

4、28a inhibitor干預(yù)的U87細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過(guò)Luciferase實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-128a與Bmi-1 mRNA3'-UTR的結(jié)合情況。通過(guò)Western blot分析p-Akt、Total Akt、p-FAK、MMP-9蛋白在miR-128amimics和miR-128a inhibitor干預(yù)的U87細(xì)胞中的表達(dá)水平。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析miR-128a mimics和miR-128a inhibitor干預(yù)的U87細(xì)胞

5、的凋亡水平以及細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:建立了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87 GBM細(xì)胞系。與對(duì)照組和IDH1WT組相比，過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87細(xì)胞出現(xiàn)增殖減緩、遷移和侵襲能力下降(P＜0.05)。HIF-1α在過(guò)表達(dá)IDH1R132H的U87細(xì)胞中表達(dá)升高(P＜0.05)，Chip實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-1α能夠結(jié)合在miR-128a啟動(dòng)子的HRE(P＜0.01)。與IDH1 WT GBM相比，miR-128a在IDH1

6、R132H GBM中呈現(xiàn)高表達(dá)(P＜0.01)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-128a能夠抑制細(xì)胞增殖(P＜0.01)，推測(cè)IDH1R132H通過(guò)誘導(dǎo)miR-128a的表達(dá)而抑制U87細(xì)胞增殖。miR-128a能夠靶向作用于Bmi-1的3'-UTR區(qū)(P＜0.05)，負(fù)性調(diào)節(jié)Bmi-1的表達(dá)(P＜0.05)。Western blot分析顯示miR-128a能夠負(fù)性調(diào)節(jié)p-Akt、p-FAK、MMP-9的表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示miR-